酚类抗氧化剂过氧自由基清除能力的计算研究

《Antioxidants》：Computational Study of the Peroxyl Radical Scavenging Ability of Phenolic Antioxidants

　　

慢性氧化应激的生理影响推动了对抗氧化活性的研究，即针对氧化损伤的细胞防御与修复机制。研究人员通过在M06-2X(SMD)/6-31++G(d,p)理论水平下于水和戊酸戊酯中评估氢过氧自由基（•OOH）和甲基过氧自由基（•OOCH3）清除反应的热力学与动力学量，评估了二十种先前已研究其三重抗氧化活性的酚类化合物的初级抗氧化活性。研究考虑了形式氢原子转移（f-HAT）和单电子转移（SET）机制。在水相环境中，SET被证明是大多数所研究酚类的主要机制，因为近一半的酚类产生的速率常数处于扩散控制极限内，暗示其具有生化相关性。仅有三种酚类通过f-HAT也表现出显著活性。酚类对•OOH的SET清除能力强于对•OOCH3的清除，但更高效的f-HAT目标则因情况而异。通过与其三重活性对比，研究人员表明当自由基为较简单物种（即•OOH相对于蛋白质自由基）时，热力学是抗氧化活性更好的预测指标；然而，在溶剂之间及内部以及酚类化合物之间仍出现若干Bell–Evans–Polanyi原理的不一致性。本研究考察了研究初级与三重抗氧化活性时所出现的差异，并强调了使用动力学策略研究抗氧化活性重要性。

研究背景方面，生物系统中自由基存在生理功能和有害氧化效应之间的严格调控平衡，活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）参与细胞信号传导、凋亡、免疫保护和基因表达等关键过程，但高浓度ROS会导致生物分子氧化并损害细胞功能，这种氧化剂超过抗氧化剂的氧化应激状态与心血管疾病、癌症及神经退行性疾病等慢性病风险增加相关，自由基衰老理论将累积的氧化损伤与细胞衰老水平及寿命相联系，ROS可来自环境污染等外源性输入或细胞内过程内生获得，抗氧化作用是对抗氧化应激的生化防御机制，分为酶促和非酶促，非酶促包括抗坏血酸、生育酚和谷胱甘肽等，抗氧化作用可通过清除自由基（初级活性）、防止自由基形成（次级活性）和修复氧化损伤的生物分子（三重活性）实现。现有实验测定基于样品通过SET或f-HAT等机制中和活性自由基的能力评估体外抗氧化能力，但无单一方法能完全捕获抗氧化行为，测得活性因实验条件而异，限制了方法间及机制间比较，建立标准化抗氧化活性测定法是挑战，促使计算方法的使用。此前一系列研究在相同理论水平下通过计算与氧化损伤的亮氨酸蛋白模型（N-甲酰基亮氨酰胺）在疏水和亲水溶剂中碳自由基位点修复相关的热力学和动力学量评估了多种物种的三重抗氧化活性，发现热力学预测顺序与动力学确定的顺序并不一致，Bell–Evans–Polanyi原理失效，且Wright等人用气相键解离能（Bond Dissociation Energy, BDE）和电离势（Ionization Potential, IP）预测相对反应速率与蛋白质修复速率常数存在矛盾，并呼吁对这些酚类的初级活性进行洞察。所选自由基•OOH作为最简单过氧自由基半衰期较•OH长可到达更远位置，是氧化应激已知传播者尤其在脂质过氧化中，脂质过氧化中间形成脂质过氧自由基（•OOR），故用甲基过氧自由基（•OOCH₃）模型评估化合物断链特性具生物学意义。这二十种酚类化合物的抗氧化活性此前已在热力学气相性质和蛋白质修复的三重抗氧化行为方面量化，但该组抗氧化剂在相同理论水平下的初级活性仍未被探索，且抗氧化剂可通过多种机制作用且仅靠热力学计算难以预测其行为，因此在多种反应背景下通过动力学手段确定活性具有价值。

研究人员在M06-2X(SMD)/6-31++G(d,p)理论水平于298.15 K使用Gaussian16软件包执行计算，对每种反应物、产物和过渡态物种进行几何优化及频率计算以确认过渡态含一个虚频且反应物产物无虚频，选用M06-2X泛函适于主族热化学和动力学计算，通过SMD连续溶剂化模型考虑水和戊酸戊酯（Pentyl Ethanoate, PE）分别模拟亲水和疏水细胞微环境，保持与先前三重抗氧化活性研究一致的6-31++G(d,p)基组以维持可比性。f-HAT速率常数使用常规过渡态理论（Transition State Theory, TST）计算并考虑Okuno溶剂笼效应修正及Brown数值积分程序计算的量子隧穿因子κ，当速率常数大于10⁸M^?1s^?1时按Kimball–Collins理论计算表观速率常数k_app，通过Stokes–Einstein方法由溶剂粘度求相互扩散系数D_AB得Smoluchowski稳态速率常数k_D。SET反应涉及去质子化酚阴离子与过氧自由基反应，速率常数使用TST方程并代入Marcus理论确定的SET活化能ΔG^≠_SET计算核重组能λ，并按生理pH 7.4下酚阴离子摩尔比乘以SET速率常数，pK_a值取自先前发表数据或通过ΔG–pK_a关联方程预测。

研究结果部分保留小标题说明如下。3.1 形式氢原子转移（f-HAT）反应：研究人员列出水和PE中与•OOH及•OOCH₃反应的f-HAT热力学（ΔG°）与动力学（ΔG^≠、k）量，发现•OOH的f-HAT反应普遍比•OOCH₃更放能约1.2至2.2 kcal/mol，亲水环境反应更放能，多数•OOH清除在两溶剂中放能除少数位点外，多酚内部羟基（如14⁽²⁾、17⁽¹⁾、18⁽²⁾）反应显著更放能归因于两相邻羟基稳定自由基物种，间位（meta）羟基对放能最少因无法使酚氧自由基自旋离域。动力学上所有单酚在PE中ΔG^≠低于水但k不一定更高，BHA和生育酚类似物（3–7）在PE中•OOH清除k更大，氨基酚（8–11）和芪类（12、13）在水中更快，氨基酚10和11在两种溶剂中对•OOH的f-HAT k达扩散极限10⁸M^?1s^?1，多酚总体f-HAT速率常数未达扩散极限，15总k最高，内部羟基动力学预期在水和•OOCH₃中较符合热力学但在PE中偏离，邻位羟基在PE中对•OOCH₃速率增强效应强于水，间位羟基位点k最低，单体酚f-HAT初级活性普遍快于蛋白质修复除少数PE中情况，热力学与动力学顺序在单酚内吻合但在整体及多酚中存在Bell–Evans–Polanyi原理失效差异。

3.2 单电子转移（SET）反应：研究人员报告水和PE中SET反应的ΔG°、ΔG^≠及k_SET，并给出* k_SET为对•OOH阴离子水合稳定化修正?6.1 kcal/mol的结果。所有酚类SET过氧自由基清除显著优于蛋白质修复，单酚中9种（7种）对•OOH（•OOCH₃）k达扩散极限具生理相关性，BHA中1的k_app更高，生育酚SET顺序同f-HAT及气相?ΔIP以7最快，氨基酚SET k高于其他单酚但顺序（11 > 10 > 8 > 9与11 > 8 > 10 > 9）不同于f-HAT（10 > 11 > 9 > 8），对•OOH清除均强于•OOCH₃，芪类12的•OOH k近扩散极限且SET比13高两阶与?ΔIP预测13更优矛盾。多酚20个单阴离子中9个（3个）对•OOH（•OOCH₃）具生物显著k，17⁽¹⁾的•OOH k_app达2.8×10⁹M^?1s^?1为全研究最高，内部单阴离子稳定化反映在•OOH SET趋势但•OOCH₃有时外部位点更高，EGCG组分（16–18）SET顺序为17 > 18 > 16（•OOH）与17 > 16 > 18（•OOCH₃），20⁽²⁾的•OOH与•OOCH₃k_app分别为2.0×10⁹与7.1×10⁸M^?1s^?1为多酚次高，间位取向取代位点SET k最低但仍高于f-HAT，SET与气相?ΔIP趋势偏差大如17的?ΔIP排倒数第三但k最高，仅10和11较吻合因受扩散极限制约。

讨论部分总结：研究人员在4.1考察f-HAT反应，热力学上•OOH清除较•OOCH₃放能且亲水环境更放能除三例外，取代程度决定生育酚和氨基酚放能顺序，多酚内部羟基放能更强因相邻羟基稳定自由基，间位羟基削弱放能，对位共轭取代增强放能。动力学上过渡态计算纳入电子效应对溶剂及隧穿影响，单酚在PE中ΔG^≠更低但k因结构而异，BHA和生育酚在疏水环境更高效清除•OOH，氨基酚和芪类在水中更高效，氨基酚10和11达扩散极限显示重要生化意义，多酚f-HAT无一达扩散极限以15总k最高，内部羟基预期在水和•OOCH₃符合热力学但PE中偏离，邻位效应在PE更强，间位位点最慢，单体酚初级f-HAT多快于蛋白质修复反之多酚在PE中修复更快，热力学预测较简单自由基（•OOH）动力学稍好但对•OOCH₃和蛋白质自由基变差，Bell–Evans–Polanyi原理在多酚内外、酚类间及溶剂间均出现不一致故仅靠热力学不足需动力学评估。4.2考察SET反应，水相SET是多数酚类最高效初级抗氧化途径仅9–11在f-HAT亦显著，约半数酚对•OOH和•OOCH₃SET k达扩散极限，对•OOH SET强于•OOCH₃，先前三重SET蛋白质修复可忽略而初级SET显著，SET趋势与气相?ΔIP偏差大因SET为阴离子水相反应而IP为气相中性至阳离子，扩散控制下结构差异被掩盖，热力学可作筛选但动力学提供更相关洞察。4.3总结初级抗氧化发现水相SET主导除10在f-HAT也达10⁹级，17（•OOH）和20（•OOCH₃）SET达10⁹级但f-HAT较低，酚类对•OOH SET更强于•OOCH₃，多酚在PE中三重f-HAT修复快于初级清除，单酚初级强于多重，微环境优劣依酚与自由基而异。

研究结论部分翻译：本工作评估了先前已研究其三重抗氧化活性的一组酚类的初级抗氧化活性。在生理pH和298.15 K下于水和PE中在M06-2X(SMD)/6-31++G(d,p)水平计算热力学与动力学量，评估了多家族二十种酚类化合物的•OOH和•OOCH₃自由基的f-HAT和SET清除。水环境中通过SET机制的过氧自由基清除被证明是酚类初级抗氧化行动最高效模式，除分子9、10和11在水相通过f-HAT也表现出生化显著活性（10在PE亦然）。约一半酚类（对•OOH为12/20，对•OOCH₃为9/20）给出扩散极限内SET速率常数显示生化意义。对•OOH清除的SET速率常数一致大于•OOCH₃，而少数酚在特定微环境中显示更强•OOCH₃的f-HAT清除。这些酚类不太可能通过SET参与蛋白质修复（除非被修复氨基酸含杂原子）；然而其初级与三重抗氧化活性（就f-HAT反应而言）显示通常多酚在PE中更高效蛋白质修复而非•OOH或•OOCH₃清除。另一方面单酚化合物始终显示更强初级抗氧化行为而非多酚。此外酚类显示更强蛋白质修复能力在疏水环境，但其产生优越自由基清除能力的微环境则多变取决于酚和过氧自由基物种。溶液速率常数趋势亦与Wright等人用气相热力学性质（O-H键解离能BDE和电离势IP）预测的抗氧化活性对比，虽BDE与f-HAT速率常数存若干矛盾但趋势较IP与SET速率常数更相似，由于所研SET反应大都为扩散控制决定IP的结构方面未反映于动力学结果。反应吉布斯自由能通常是动力学趋势良好预测指标，但在多酚内、酚类间及所考溶剂间识别诸多差异均导致Bell–Evans–Polanyi原理不可靠（在涉及高结构相似性物种反应时似仍适用）。虽理论测定热力学性质可作有用筛选工具，这些结果促成如下观念：动力学性质计算提供关于酚类抗氧化活性更具生化相关性的洞察。本质上本工作促进理解这些酚类化合物在过氧自由基清除背景下的抗氧化行为，可能有助于防止（•OOH）或终止（•OOCH₃）生物膜脂质过氧化，通过本研究及其修复氧化损伤蛋白模型能力的研究，已界定其初级与三重抗氧化特征。该研究论文发表在《Antioxidants》。

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