低强度刺激通过ACSL4脂质重塑和CCL9-CCR1信号驱动巨噬细胞胞葬作用促进肌腱-骨愈合

《SCIENCE ADVANCES》：Low-intensity stimulation drives macrophage efferocytosis via ACSL4 lipid remodeling and CCL9-CCR1 signaling for tendon-bone healing

　　

运动康复诱导的肌腱-骨愈合的机制尚不清楚。利用前交叉韧带重建的小鼠模型，研究人员发现低强度机械刺激通过酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）介导的脂质代谢重编程，促进了肌腱-骨界面的巨噬细胞M2极化、吞噬和胞葬作用（efferocytosis）。Acsl4沉默减少了脂肪酸氧化和胞葬作用，损害了运动康复诱导的肌腱-骨愈合。值得注意的是，CCL9-CCR1轴在巨噬细胞胞葬作用后促进了骨髓基质细胞（BMSC）归巢。此外，工程化表达CCL9的外泌体加速了肌腱-骨修复。

**论文解读：低强度机械刺激通过ACSL4脂质重塑和CCL9-CCR1信号驱动巨噬细胞胞葬作用促进肌腱-骨愈合**

**研究背景与问题**

前交叉韧带（ACL）断裂是常见运动损伤，若未及时治疗可严重损害膝关节功能，加速骨关节炎发生，降低生活质量，甚至导致关节残疾。手术重建是恢复膝关节功能的主要方法，但3%至7%的患者需二次手术，主要原因为移植物失败，其中生物学失败（移植物-骨整合不良）占20%至30%。术后早期运动康复可改善膝关节功能并促进肌腱-骨愈合，部分通过促进巨噬细胞M2极化、降低修复部位炎症反应强度实现。然而，机械应力如何调控巨噬细胞功能以促进肌腱-骨愈合的分子机制尚不明确。巨噬细胞活化与代谢重编程紧密相关，M2型巨噬细胞依赖脂肪酸氧化和氧化磷酸化以促进组织修复。胞葬作用（efferocytosis）是清除凋亡细胞的过程，为巨噬细胞提供脂肪酸用于氧化，直接影响其功能状态。酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）是脂肪酸代谢的关键调控因子，但其在巨噬细胞胞葬作用和肌腱-骨愈合中的作用未知。本研究旨在探索低强度机械刺激通过ACSL4和CCL9-CCR1信号轴驱动巨噬细胞胞葬作用促进肌腱-骨愈合的机制。

**研究内容与结论**

研究人员利用前交叉韧带重建（ACLR）小鼠模型，发现低强度跑台运动显著促进肌腱-骨愈合，增强移植物力学性能和骨形成。体外实验显示，低强度机械刺激（5%应变，0.5 Hz，24小时）促进巨噬细胞M2极化、吞噬功能和胞葬作用。通过代谢组学和转录组学分析，鉴定出ACSL4介导的脂质代谢重编程是低强度机械刺激促进M2极化的关键机制；Acsl4沉默降低脂肪酸氧化和胞葬作用，削弱运动康复诱导的愈合。进一步研究发现，巨噬细胞胞葬作用后分泌趋化因子CCL9，通过CCL9-CCR1轴促进骨髓基质细胞（BMSC）归巢。基于此，研究人员构建了过表达CCL9的工程化外泌体，并封装于缓释水凝胶中，在ACLR小鼠模型中显示出持续释放特性和显著促进肌腱-骨愈合的效果，包括改善组织学评分、力学性能和骨形成。

**重要意义**

该研究揭示了低强度机械刺激通过ACSL4脂质重塑和CCL9-CCR1信号驱动巨噬细胞胞葬作用促进肌腱-骨愈合的分子机制，为运动康复的生物学基础提供新见解，并为临床转化提供了基于工程化CCL9外泌体的潜在治疗策略。论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。

**关键技术方法**

1. **小鼠模型与运动干预**：采用C57BL/6小鼠建立ACLR模型，设定低（5 m/min）、中（10 m/min）、高（15 m/min）强度跑台运动（每日35分钟，含5分钟热身），持续8周。
2. **体外力学刺激系统**：利用Flexcell张力系统对骨髓来源巨噬细胞（BMDM）施加循环拉伸应变（5%、10%、20%，0.5 Hz，24小时），模拟不同康复强度。
3. **代谢组学与转录组学分析**：液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行非靶向代谢组学，RNA测序（RNA-seq）进行转录组学，结合KEGG富集分析鉴定ACSL4介导的脂质代谢重编程。
4. **单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析**：获取公共数据集GSE171480，利用Seurat和CellChat分析肌腱-骨愈合界面巨噬细胞亚群及其趋化因子信号网络。
5. **工程化外泌体构建与表征**：利用慢病毒系统在BMSC中过表达Ccl9，通过超速离心法提取外泌体，采用透射电镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）、zeta电位和Western blot（WB）表征，并封装于纤维蛋白原/凝血酶缓释水凝胶中。

**研究结果**

**Low-intensity treadmill exercise promotes tendon-bone healing after ACLR**
通过组织学染色（H&E、Masson、Safranin O/Fast Green）、生物力学测试和显微CT（micro-CT）分析，发现低强度跑台运动组小鼠在术后4周和8周表现出更佳的肌腱-骨界面愈合（更高的细胞密度、更连续的界面、更多的纤维软骨形成）、更大的移植物最大负荷和刚度、更小的骨隧道面积和更高的骨体积分数（BV/TV），而中高强度运动则延迟愈合。

**Low-intensity mechanical stimulation enhanced macrophage polarization toward M2 and improved phagocytic function**
体外实验显示，5%拉伸刺激上调BMDM中Piezo1和Yap1的mRNA表达，抑制促炎基因（Tnf、Il1b、Il6）并促进M2标志物（Mrc1、Arg1）表达。KEGG富集分析显示“Phagosome”通路显著上调。免疫荧光和流式细胞术证实低强度机械刺激增强巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬能力。

**Enhanced M2 macrophage polarization improves phagocytic function**
在低强度跑台运动小鼠中，肌腱-骨界面CD206和MerTK阳性巨噬细胞比例增加。利用M2偏向（Rheb1KO）和M1偏向（TSC1KO）转基因小鼠，发现Rheb1KO小鼠巨噬细胞吞噬率更高，凋亡细胞（cleaved caspase-3）更少，证实M2极化增强胞葬作用。

**Macrophage phagocytosis and efferocytosis enhance tendon-bone healing**
在Rheb1KO、TSC1KO和野生型小鼠中进行ACLR并评估愈合，Rheb1KO小鼠组织学评分、移植物最大负荷和刚度、骨隧道BV/TV均显著优于其他组，而TSC1KO小鼠最差，表明巨噬细胞胞葬作用促进肌腱-骨愈合。

**Low-intensity mechanical stress promotes M2-like macrophage polarization through ACSL4-dependent lipid metabolic remodeling**
代谢组学显示低强度刺激后脂肪酸氧化增强。转录组与代谢组关联分析发现Acsl4表达与脂质代谢物负相关。WB和qRT-PCR证实ACSL4上调。ACSL4抑制剂PRGL493削弱低强度运动诱导的愈合。siRNA沉默Acsl4降低脂肪酸氧化相关基因（Cpt1a、Cpt1b、Hadh）和CD206表达，并减少巨噬细胞吞噬率，表明ACSL4是机械应力调控脂质代谢和M2极化的关键分子。

**Macrophage efferocytosis accelerates tendon-bone healing by promoting BMSC homing**
通过MRX-2843抑制胞葬作用后，Rheb1KO小鼠和低强度运动组小鼠的组织学评分、移植物力学性能下降。Transwell和划痕实验显示抑制胞葬后BMSC迁移能力减弱。免疫荧光显示肌腱-骨界面CD44和CD29阳性细胞减少，提示BMSC归巢受损。

**Macrophage efferocytosis up-regulates CCL9 expression and activates CCL9-CCR1 signaling**
scRNA-seq分析鉴定出单核细胞来源巨噬细胞为主要胞葬活性细胞，CellChat预测CCL9-CCR1为关键配体-受体通路。体外BMDM与凋亡细胞共培养后RNA-seq显示Ccl9显著上调。ELISA和qRT-PCR验证胞葬后CCL9分泌增加，MRX-2843抑制后下降。体内低强度运动小鼠CCL9表达增加，PRGL493或AF463（CCL9中和抗体）处理则降低并抑制愈合。

**Characterization of CCL9-enriched engineered exosomes**
成功构建过表达CCL9的BMSC外泌体（EXO-CCL9），TEM显示典型杯状形态，NTA示粒径100-200 nm，zeta电位-14.1 mV，WB确认外泌体标志物（CD63、CD81）和CCL9表达。缓释水凝胶实现在14天内持续释放CCL9，体内荧光成像显示外泌体在骨隧道内滞留7-21天。

**CCL9-enriched engineered exosomes accelerate tendon-bone healing**
在ACLR小鼠骨隧道内注射EXO-CCL9缓释水凝胶，8周后组织学评分、移植物最大负荷和刚度、骨隧道BV/TV均显著优于对照组和普通外泌体组。免疫荧光显示CD44和CCR1阳性细胞增多，表明CCL9/CCR1轴促进BMSC归巢，加速肌腱-骨愈合。

**总结讨论与结论**

讨论部分指出，低强度跑台运动通过ACSL4增强巨噬细胞脂质代谢重编程，改善吞噬和胞葬功能，清除凋亡细胞，减轻炎症，优化巨噬细胞代谢状态，促进组织修复。胞葬后巨噬细胞分泌CCL9，通过CCR1激活BMSC迁移和归巢，加速愈合。研究揭示了低强度运动康复促进肌腱-骨愈合的分子机制，并提供了通过构建过表达CCL9的工程化外泌体实现临床转化的策略。研究局限包括小鼠模型与人类术后愈合的差异、未设置健康ACL力学基准、未排除其他信号通路的贡献等，未来需更大样本、更长随访、直接对比天然韧带性能及大动物模型验证。研究结论：低强度机械刺激通过ACSL4脂质代谢重编程和CCL9-CCR1信号驱动巨噬细胞胞葬作用，促进肌腱-骨愈合，工程化CCL9外泌体为临床治疗提供了新策略。