Roxadustat稳定HIF1改善阿尔茨海默病认知功能并防止神经元丢失的体内研究

《Biology》：HIF1 Stabilization by Roxadustat Improves Cognition and Prevents Neuron Loss in Alzheimer’s Diseases In Vivo

　　

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是全球最常见的神经退行性疾病之一，其特征为进行性记忆障碍、认知功能下降和行为功能障碍。大脑的高能量需求使其易受缺氧影响，而缺氧可触发AD病理。缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor, HIF）是一种介导细胞和组织对低氧水平适应的转录因子。HIF-1在AD中发挥双重作用：一方面，它被认为是一个潜在的神经保护靶点；另一方面，其激活可能通过促进淀粉样斑块形成而加剧疾病发病机制。鉴于这种不确定性，需要进一步研究。本研究在6月龄雄性5xFAD小鼠中研究了HIF脯氨酰羟化酶（HIF prolyl hydroxylase）抑制剂罗沙司他（Roxadustat）。HIF-1复合物的稳定化对6月龄雄性5xFAD小鼠的学习能力和长期空间记忆的保留产生了积极影响。为期四周的罗沙司他治疗显著减少了前额叶皮层细胞的病理形态学改变。此外，接受罗沙司他治疗的动物脑皮层中脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）的表达显著增加。研究人员的结果表明，通过抑制HIF脯氨酰羟化酶来稳定HIF-1复合物可能代表一种有前景的AD神经保护策略。

**论文解读：Roxadustat稳定HIF-1改善阿尔茨海默病小鼠认知功能并防止神经元丢失**

**研究背景与问题**
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是常见的神经退行性疾病，以记忆和认知进行性下降为特征。大脑高能耗使其对缺氧敏感，缺氧可通过多种机制加速AD病理，包括增加β-淀粉样蛋白（beta-amyloid, Aβ）产生、促进tau蛋白过度磷酸化、诱导氧化应激和神经炎症等。缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1, HIF-1）是细胞适应低氧的关键转录因子，但它在AD中的作用存在争议：一方面，HIF-1可促进促红细胞生成素（erythropoietin, EPO）和血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A, VEGFA）表达，改善脑血流，并发挥抗凋亡和神经营养作用；另一方面，HIF-1可能上调BACE1表达，增加Aβ生成，从而加剧疾病。因此，HIF-1在AD中是保护还是有害尚不明确，需要进一步研究。本研究旨在探讨HIF脯氨酰羟化酶（prolyl hydroxylase domain, PHD）抑制剂Roxadustat（罗沙司他）在AD小鼠模型中的效应，评估其是否通过稳定HIF-1复合物发挥神经保护作用。论文发表在《Biology》。

**关键技术与方法**
研究人员使用6月龄雄性5xFAD转基因小鼠（携带APP和PSEN1五种突变，快速出现淀粉样病理和认知障碍）及同背景野生型（wild-type, WT）小鼠（n=29），分为三组：WT组、5xFAD未处理组、5xFAD + Roxadustat组（腹腔注射10 mg/kg，每三天一次，持续4周）。主要技术方法包括：神经缺陷严重程度评分（13项测试评估运动、反射和姿势）；旷场实验（Open Field test）评估运动与探索活动；被动回避条件反射（conditioned passive avoidance, CPA）测试评价恐惧记忆；Morris水迷宫（Morris water maze）评估空间学习与长期记忆；脑组织前额叶皮层（prefrontal cortex, PFC）的苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色进行形态学分析；定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）检测HIF-1_α、BDNF、GDNF、IL-1_β、IL-6、TNF-_α和APP的mRNA表达。

**研究结果**

**3.1 慢性Roxadustat给药对5xFAD小鼠神经缺陷进展和运动活动的影响**
通过每周神经缺陷评分和旷场实验发现：5xFAD未处理组神经状态进行性恶化，运动探索活动增强（表现为垂直站立次数增加、总距离和速度升高、冻结时间减少）；而Roxadustat处理组神经状态保持稳定，仅轻度受损，运动探索活动显著低于5xFAD组，与WT组无差异，但表现出焦虑样行为增加（冻结时间延长）。结论：Roxadustat稳定HIF-1可减缓神经缺陷进展，但伴随焦虑样行为。

**3.2 慢性Roxadustat给药对5xFAD小鼠认知功能和记忆的影响**
被动回避测试显示：训练后24小时所有动物均保留记忆痕迹；但一个月后，5xFAD组记忆消退（进入暗箱潜伏期与训练时无差异），WT组90%保持记忆，Roxadustat组潜伏期显著延长，但仍有33%动物进入暗箱。Morris水迷宫测试表明：Roxadustat组在训练第5天定位平台潜伏期显著短于5xFAD组，学习能力更优；在记忆保留测试中，Roxadustat组在目标象限搜索时间与WT组无差异，而5xFAD组搜索时间显著增加（提示记忆障碍）。结论：慢性Roxadustat给药改善学习能力，部分防止长期空间记忆受损。

**3.3 慢性Roxadustat给药对促炎细胞因子和神经营养因子mRNA表达的影响**
qRT-PCR分析前额叶皮层mRNA表达显示：Roxadustat组HIF-1_α mRNA表达较WT组显著升高，较5xFAD组升高2.73倍；BDNF mRNA表达较5xFAD组升高2.1倍；APP mRNA表达高于WT组，但与5xFAD组无差异；促炎细胞因子IL-1_β、IL-6、TNF-_α表达在各组间无显著差异。结论：Roxadustat稳定HIF-1并增加BDNF表达，但未显著改变促炎细胞因子水平。

**3.4 前额叶皮层的组织学变化**
H&E染色分析显示：WT组神经元形态正常，偶见细胞周围水肿和深染神经元。5xFAD组出现显著病理改变：神经元胞体增大、核增大、深染神经元增多（包括非皱缩和皱缩型）、凋亡/坏死细胞、鬼影细胞、肿胀细胞、细胞周围水肿和细胞质空泡化增多，血管周围间隙扩大，血管壁变薄，并出现局灶性神经元丢失区。Roxadustat组细胞形态明显改善：坏死和凋亡细胞减少39.5%，鬼影细胞减少37.12%，肿胀细胞减少49.71%，局灶性神经元丢失区面积减小且频率降低1.9倍，血管周围水肿减轻，新生血管增多。结论：Roxadustat处理显著减少前额叶皮层病理形态学改变，发挥神经保护作用。

**讨论与结论**
讨论部分指出，慢性缺氧是AD重要诱因，HIF-1稳定化可增强细胞适应能力。Roxadustat作为PHD抑制剂，已用于治疗肾性贫血，且能部分透过血脑屏障。本研究中，Roxadustat改善5xFAD小鼠神经状态和学习能力，但未显著影响记忆保留，可能与治疗结束到行为测试间隔过长有关。组织学结果显示Roxadustat减少前额叶皮层神经元损伤和死亡，这与该区域在空间导航和工作记忆中的关键作用一致。基因表达分析提示BDNF上调可能介导了部分神经保护效应，但因果关系需进一步验证。此外，Roxadustat对促炎细胞因子表达无显著影响，可能需要更深入评估神经炎症指标。研究局限性包括未直接测量HIF-1_α蛋白水平，以及缺乏对突触可塑性的电生理学评估。

**研究结论**：为期四周的Roxadustat给药对雄性5xFAD小鼠的神经状态和学习能力产生了积极影响，同时观察到脑皮层病理形态学改变减少。这些发现表明，与HIF-1稳定化相关的神经保护效应至少部分由神经营养因子BDNF表达增加所介导，但因果关系需进一步确认。