进行性肠道肿瘤细胞可塑性、Myc活化及Lgr5+肿瘤干细胞谱系定向能力在Wnt耗竭后的丧失

《SCIENCE ADVANCES》：Progressive intestinal tumor cell plasticity, Myc activation, and loss of Lgr5+ tumor stem cell lineage commitment upon Wnt depletion

　　

可塑性（plasticity）是指肿瘤细胞经历表型转变的能力，它促进结直肠癌（CRC）的进展和治疗抵抗。尽管可塑性在晚期CRC中很明显，但关于早期肿瘤和肿瘤干细胞中的可塑性知之甚少。在这里，研究人员证明，可塑性细胞状态（PCS）已经存在于家族性腺瘤性息肉病（FAP）患者的息肉和小鼠肠道腺瘤中，其中PCS与PROX1⁺肿瘤干细胞相关。此外，研究人员分析了在Apc突变小鼠中缺失典型Wnt效应因子Tcf7或Lef1后的进行性可塑性。缺失任一基因均导致新的可塑性肿瘤细胞群体的出现、富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（Lgr5）肿瘤干细胞向肠上皮样细胞分化的失败、Myc通路活化的增强以及肿瘤细胞增殖和肿瘤发生的增加。综上所述，研究人员证明PCS与早期CRC发展相关，并确定了在进行性肿瘤细胞可塑性过程中激活的多个潜在可药用机制。

论文解读文章

一、研究背景、存在问题与研究意义

结直肠癌（CRC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其预后受远处转移的显著影响。肿瘤细胞可塑性（plasticity），即肿瘤细胞经历表型转变的能力，包括谱系内可塑性（intralineage plasticity）和跨谱系可塑性（translineage plasticity），是驱动CRC转移的关键因素。尽管在晚期CRC中可塑性已被广泛研究，但在早期肿瘤及肿瘤干细胞中的可塑性机制尚不明确。经典Wnt/β-catenin信号通路因腺瘤性息肉病（APC）基因突变在大多数CRC患者中过度激活，是腺瘤-癌序列的起始事件。然而，经典Wnt信号缺失后肿瘤细胞如何逐步丧失典型细胞状态并启动跨谱系重编程，其后续步骤尚未充分表征。本研究旨在探索早期CRC中肿瘤干细胞的塑性状态，并阐明经典Wnt效应因子Tcf7或Lef1缺失后进行性可塑性的机制。论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。

研究人员选取家族性腺瘤性息肉病（FAP）患者息肉样本和Apc突变小鼠肠道腺瘤模型，结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq），系统分析了肿瘤干细胞在Wnt通路调控下的可塑性演变。研究发现，可塑性细胞状态（PCS）已存在于早期腺瘤的PROX1⁺肿瘤干细胞中，而Tcf7或Lef1缺失导致跨谱系可塑性增强、肿瘤干细胞分化受阻、Myc信号激活及肿瘤加速生长。该研究揭示了早期CRC中可塑性的存在，并识别出多个潜在可药用机制，为理解CRC进展和治疗抵抗提供了新视角。

二、关键技术方法概述（不超过250字）

本研究主要采用以下关键技术方法：（1）单细胞RNA测序（scRNA-seq），分析来自FAP患者息肉样本（GSE201348）、健康个体及CRC患者样本，以及小鼠肠道腺瘤样本（包括LApc、LApcT、LApcLef1模型）的转录组；（2）转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq），比较LApc与LApcLef1肿瘤细胞的染色质开放性；（3）基因集富集分析（GSEA）和模块富集评分；（4）小鼠模型构建，使用Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2重组酶系统在Apc突变背景上诱导Tcf7或Lef1缺失；（5）免疫荧光染色和器官培养实验验证关键蛋白表达和功能；（6）基于CRC患者队列（GSE39582）的生存分析，生成可塑性基因签名并评估其预后价值。样本队列来源包括FAP息肉患者和CRC患者（GSE39582），以及实验室自建小鼠模型。

三、研究结果

1. 人肠道息肉和小鼠腺瘤中的肿瘤干细胞具有高度可塑性
通过重新分析人scRNA-seq数据（GSE201348）发现，FAP息肉和CRC样本中共有的肿瘤特异性细胞簇高表达PROX1，同时表达多种跨谱系可塑性标志物，表明早期肿瘤中已存在可塑性细胞状态（PCS）。在小鼠LApc腺瘤中，同样发现肿瘤特异性细胞簇（簇1）富含PROX1⁺细胞并显示跨谱系可塑性基因特征。Tcf7或Lef1缺失进一步增加了肿瘤特异性细胞簇的比例和转录多样性。

2. Tcf7或Lef1缺失增强跨谱系可塑性
对全部肿瘤细胞的GSEA分析显示，Tcf7或Lef1缺失导致经典肠上皮基因集表达下降，而肿瘤胎儿和非经典可塑性基因集表达上升，包括Yap1靶基因和AP-1亚基相关基因。模块评分表明，额外缺失Tcf7或Lef1显著增强吸收型上皮-肿瘤胎儿谱系转换，同时负向富集Lgr5⁺细胞丢失后上调的基因特征，提示不可逆的谱系丢失。

3. Tcf7或Lef1缺失激活AP-1亚基编码基因
ATAC-seq分析发现，Lef1缺失增加了AP-1亚基（Fos、Fosl2、Jun、Batf等）和Sox家族（如Sox17）转录因子基序的染色质开放性，同时降低了肠上皮保护因子（Hnf4a、Rxra、Ppard等）的开放性。scRNA-seq证实这些基因的RNA表达变化与染色质开放性一致，且非经典Wnt信号成分表达上调。

4. Kras突变抑制腺瘤中Lef1和Prox1表达
在Apc^Min/+;Kras^LSL-G12D/+小鼠肿瘤中，免疫荧光染色显示Lef1和Prox1表达显著下降，但Tcf1不变。CRC患者微阵列数据（GSE39582）中，CMS3亚型（KRAS突变型）的LEF1和TCF7表达低于CMS2亚型，支持Kras突变驱动经典Wnt由高活性向低活性状态转换。

5. Tcf7或Lef1缺失后Prox1表达降低
免疫荧光和scRNA-seq显示，Tcf7或Lef1缺失肿瘤中Prox1阳性细胞减少，而肿瘤胎儿标志物Anxa1和成骨细胞标志物Msx1表达升高。Anxa1⁺细胞主要呈Prox1阴性，而Msx1⁺细胞高表达Prox1，表明两种细胞群为不同谱系。

6. 进行性可塑性抑制Lgr5⁺肿瘤干细胞谱系定向
细胞类型比例分析显示，Tcf7或Lef1缺失导致肠上皮样肿瘤细胞比例显著下降（LApcT vs LApc：11% vs 78%）。伪时间分析（Monocle3）显示缺失样本中细胞伪时间值更低，表明分化受阻。差异表达基因（DEG）分析发现分化抑制因子Id1-3和Sox9在肿瘤特异性簇及干/祖细胞中表达上调。

7. 可塑性相关的肿瘤细胞增殖和生长增加依赖Myc
Tcf7缺失导致小鼠生存期显著缩短（平均24天 vs 68天），增殖标志物Mki67表达和增殖细胞比例升高。GSEA显示Myc、E2F、G2-M通路激活。对照组中Tcf7⁺Lef1⁺双阳性干细胞的Myc活性受抑制。器官培养中，EN4（Myc抑制剂）处理可消除Tcf7缺失诱导的类器官增大，证明Myc在促进肿瘤生长中的关键作用。

8. 高TCF7表达减弱跨谱系可塑性的不良预后影响
基于GSE39582队列，研究人员生成了跨谱系可塑性和肿瘤胎儿基因签名，发现其与复发自由生存期（RFS）和总生存期（OS）呈负相关。联合分析显示，TCF7低表达而可塑性评分高的患者（Q1_Q4）OS最差，而高TCF7表达可部分逆转这一不良预后，提示TCF7的临床保护作用。

四、讨论与结论

讨论部分指出，经典Wnt信号通过Tcf7和Lef1限制肿瘤细胞增殖，其缺失导致从经典Wnt高活性状态向低活性状态转变，同时增强非经典Wnt/Ca²⁺和Wnt/PCP通路成分表达，后者与侵袭、生存和转移相关。PROX1⁺干细胞在早期腺瘤中已显示可塑性状态，而Tcf7/Lef1缺失导致Prox1表达下降，但不同可塑性程序（Anxa1⁺ vs Msx1⁺）中Prox1表达差异显著。Lgr5⁺干细胞的分化受阻与Id1-3和Sox9上调相关，这与分化抑制作为CRC前驱事件的模型一致。染色质可及性变化模拟了晚期模型中的渐进性重编程。Myc依赖性增殖抑制为可塑性相关肿瘤生长提供了潜在治疗靶点。此外，Kras突变导致的LEF1下调可能是CRC中可塑性的重要非遗传驱动因素。TCF7与生存的正相关证实了临床相关性。

结论部分：总之，研究人员表明，典型Wnt信号通过维持Lgr5⁺细胞的稳态谱系定向来抑制进行性谱系内和跨谱系可塑性。然而，由于息肉和腺瘤中的肿瘤干细胞高表达典型Wnt靶基因和跨谱系可塑性标志物，典型Wnt信号在控制可塑性方面的作用比迄今为止描述的更为复杂。