人Tr1细胞的表观遗传图谱、关键转录调控因子及其体内鉴定

《SCIENCE ADVANCES》：Epigenetic landscape, key transcriptional regulators, and in vivo identification of human Tr1 cells

　　

摘要　1型调节性T（Tr1）细胞是具有抑制功能的CD4⁺ T细胞，由常规T细胞在暴露于持续性或强抗原后诱导产生。人Tr1细胞研究尚不充分；其抗原驱动分化的调控因子尚不明确，而且在发生抗原相互作用的组织中鉴定此类细胞具有挑战性。研究人员在本研究中对人抗原诱导的Tr1细胞开展了多组学（multiomic）谱系分析。利用基于CRISPR的功能基因组学（functional genomics），揭示了转录因子IRF4、BATF和MAF在人Tr1分化、表型与功能中的关键作用。研究进一步建立了Tr1转录特征（transcriptional signature），可在接受Tr1治疗的患者以及实体瘤患者的单细胞数据集中检测具有Tr1表型的细胞。跨物种分析证实，该特征能够识别小鼠实体瘤模型中于体内诱导形成的真正Tr1细胞。上述发现为Tr1基础治疗（Tr1-based therapy）、Tr1靶向治疗（Tr1-targeting therapy）的开发以及Tr1细胞生物学研究提供了框架。

该论文发表于《SCIENCE ADVANCES》，围绕人1型调节性T（Tr1）细胞的分化调控与体内识别两大核心问题展开系统研究。Tr1细胞属于FOXP3阴性的调节性CD4⁺ T细胞，通常在外周成熟常规T细胞接受持续性或强抗原刺激、并处于免疫耐受性环境时诱导形成。既往研究表明，Tr1细胞具有显著免疫抑制功能，在移植物耐受、过敏、感染及慢性炎症中可能发挥保护作用；但在实体瘤中，Tr1细胞又可能抑制抗肿瘤免疫、削弱免疫治疗效果。因此，准确界定人Tr1细胞的分子特征、解析其关键转录调控网络，并在体内尤其是组织微环境中可靠识别Tr1细胞，具有重要理论价值与临床意义。现有问题主要在于：人Tr1细胞研究不足，其抗原驱动分化的主导转录因子缺乏共识；同时，外周血中可用于识别Tr1的CD49b与LAG3共表达标志，在组织中稳定性和适用性有限，导致体内Tr1细胞难以精确定义。基于此，研究人员构建了人抗原诱导Tr1细胞的多层次分子图谱，并结合功能验证与跨数据集分析，建立了Tr1细胞的识别框架。

本研究以体外诱导的人抗原特异性Tr1细胞为核心对象，整合整体ATAC-seq、RNA-seq、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、单细胞T细胞受体测序（scTCR-seq）、单细胞多组学（sc-multiome：RNA+ATAC）及CRISPR功能基因组学，系统解析Tr1细胞的染色质可及性、转录状态、克隆扩增特征及调控因子依赖性。研究结论显示：人抗原诱导Tr1细胞具有独特的表观遗传景观与转录程序；IRF4、BATF和MAF是其关键且大体非冗余的调控因子，其中IRF4影响Tr1分化与抑制功能，BATF影响细胞毒相关表型，MAF调控IL-10产生并可促进Tr1细胞产量增加。进一步地，研究建立的Tr1转录特征能够在接受T-allo10治疗的患者外周血单细胞数据、多个实体瘤公开数据集以及小鼠肿瘤模型中识别具有Tr1特征的细胞。该研究的重要意义在于，不仅回答了人Tr1细胞“如何形成”的关键调控问题，也为“如何在体内识别Tr1细胞”提供了可操作的分子工具，对Tr1相关细胞治疗、肿瘤免疫微环境研究及靶向调控策略开发均具有直接启发价值。

研究所用主要关键技术方法包括：基于健康供者外周血CD4⁺ T细胞与同种异体耐受性树突状细胞（DC-10）共培养建立T-allo10体系诱导Tr1分化；采用整体ATAC-seq与RNA-seq绘制表观遗传和转录图谱；采用5′ scRNA-seq联合TCR-seq解析单细胞转录状态与克隆谱；采用纵向sc-multiome分析分化过程中的动态染色质与转录变化；采用CRISPR-Cas9敲除与CRISPRa激活验证IRF4、BATF、MAF、EOMES功能；并纳入接受T-allo10治疗并行同种异体造血干细胞移植（allo-HSCT）患者外周血样本，以及公开的人ccRCC、CRC、TNBC与小鼠肉瘤单细胞数据集开展体内验证。

以下为论文结果部分的凝练解读。

Human antigen-induced Tr1 cells have a unique epigenetic landscape
研究人员首先通过整体ATAC-seq与RNA-seq分析T-allo10体系诱导的人Tr1细胞，并与3类对照群体比较：外周血总CD4⁺ T细胞、T-allo10产物中的CD49b^?LAG3^?非Tr1记忆T细胞，以及T-allo对照体系中的效应T（Teff）细胞。结果显示，Tr1细胞在转录因子基序可及性上与其他细胞群明显分离，AP-1、MAF、IRF及T-box家族基序在Tr1中更为开放；TOBIAS足迹分析进一步支持这些转录因子在Tr1中处于活跃状态。差异开放染色质峰分析显示Tr1细胞具有大量特异性开放区域，并富集于Treg与记忆T细胞相关免疫特征。上游调控分析将IRF4、MAF和BHLHE40确定为最重要的候选转录调控因子。结合GREAT与FigR分析，研究还发现CTLA4、PDCD1、CXCR6、FURIN、IL10等经典Tr1相关基因，以及MAF、IRF4、BATF、TBX21等转录因子所在区域构成Tr1特异性调控染色质结构域（DORC）。该部分结果说明，人抗原诱导Tr1分化伴随显著染色质重塑，并形成特异调控网络。

Human antigen-induced Tr1 cells exhibit a distinct transcriptional profile and oligoclonal TCR repertoire at the single-cell level
为在单细胞水平验证上述发现，研究人员对2份T-allo10产物进行5′ scRNA-seq与TCR-seq联合分析。结果显示，Tr1细胞形成独立簇，表达LAG3、ITGA2、IL10、IFNG、CTLA4、FURIN、GZMA、CXCR6等标志基因，并占据较高比例的克隆扩增细胞。TCR互补决定区3（CDR3）相似性分析表明，Tr1簇内细胞具有明显克隆相关性，支持其在抗原驱动下发生寡克隆扩增。与FOXP3⁺ Treg相比，Tr1细胞高表达LAG3、FURIN、KLRB1、GZMA、CCL5、IL7R以及BHLHE40、NFIL3、CEBPD等；与TH1相比，Tr1细胞高表达LAG3、CTLA4、FURIN和MAF，而TH1则更偏向PRF1、NKG7、GZMH等细胞毒程序。Tr1再聚类后可分为Tr1-A与Tr1-B两个亚群，二者差异较小，但Tr1-B更偏活化状态，Tr1-A则更具IL-7R相关静息记忆特征，RNA velocity分析提示前者由后者发展而来。该部分结果界定了人Tr1细胞独特的单细胞转录特征、寡克隆TCR谱及活化连续状态。

Longitudinal single-cell multiome profiling of antigen-induced Tr1 cells reveals unique transcriptional programs and those shared with activated FOXP3⁺ cells
研究人员进一步对2名供者来源的T-allo10培养体系在第0、3、6、9天进行纵向sc-multiome分析，共获得45,262个细胞，从而描绘Tr1分化动态过程。结果发现，Tr1富集簇主要出现在培养后期，并表达LAG3、ITGA2、IL10、CTLA4等基因。RNA velocity提示，增殖/细胞毒样簇可能为Tr1前体状态。MAF和IRF4基序在Tr1富集簇及增殖簇中高度开放，TBX21与EOMES则呈中等可及性，而GATA3和BCL6不开放，提示Tr1并非TH2或TFH型程序。通过提高聚类分辨率，研究将Tr1样群体与FOXP3⁺群体进一步分开，识别出多个Tr1亚簇与活化Treg（aTreg）亚簇。比较显示，BHLHE40、MAF、NFIL3、RBPJ、ZEB2、RUNX2以及CCR5、PDCD1、CCL5、GZMA、GZMB、IL10、IFNG、IL21等更偏Tr1特异，而FOXP3、IKZF2、IL2RA、LRRC32则局限于Treg/aTreg。值得注意的是，IRF4、BATF、VDR、TOX2及部分共抑制分子在Tr1与aTreg间共享，提示二者存在部分共同调控模块。轨迹分析还发现，RORC等TF在Tr1分化较早阶段可及性较高，而IRF4和BATF在后期增强，MAF表达整体维持高水平但沿伪时间略有下降。该结果揭示了Tr1分化的时序性调控程序，以及Tr1与活化FOXP3⁺细胞的共同点与差异点。

IRF4, BATF, and MAF regulate human antigen-induced Tr1 cells
在机制验证部分，研究人员利用CRISPR-Cas9于未刺激初始CD4⁺ T细胞中分别敲除IRF4、BATF、MAF和EOMES，再诱导Tr1分化。IRF4敲除显著降低T-allo10体系中的Tr1细胞频率，减弱LAG3和CTLA-4表达，并削弱整体抑制功能，说明IRF4不仅参与Tr1表型建立，还对其分化与免疫抑制活性至关重要。BATF敲除并不影响Tr1分化比例，但显著降低Tr1及记忆CD4⁺细胞中的颗粒酶B（GZMB）表达，同时削弱LAG3与CTLA-4表达，提示BATF主要参与细胞毒/活化表型维持。MAF敲除对Tr1频率、LAG3、CTLA-4及抑制实验读出影响不明显，但显著降低Tr1细胞IL-10产生，符合MAF作为IL-10关键调节因子的已知功能。相对地，尽管EOMES在表观遗传上呈活性，但其敲除未显著影响Tr1诱导或脱颗粒能力。进一步采用CRISPRa短暂上调MAF后，研究人员观察到MAF表达增强、培养上清IL-10有增加趋势且Tr1细胞产量显著提升。该部分结果直接证明，IRF4、BATF和MAF是人抗原诱导Tr1细胞生物学中的关键调节因子，且分工不同。

Tr1 signature identifies Tr1 cells among peripheral blood CD4⁺ T cells of patients treated with Tr1-enriched T-allo10 therapy
鉴于体外诱导Tr1与外周血静息Tr1在单个标志物表达上存在差异，研究人员尝试以“特征”而非“单标志物”方式识别体内Tr1。首先，基于体外诱导Tr1、非Tr1及亲本CD4⁺ T细胞的ATAC数据构建CIBERSORTx转录因子基序特征矩阵，并用于分析接受T-allo10输注及allo-HSCT治疗患者在治疗后第35、90、300天的外周血总CD4⁺ T细胞。结果显示，数字细胞术估算的Tr1比例与流式细胞术测得比例显著相关，支持Tr1细胞在体内长期持续存在。随后，研究人员依据体外Tr1细胞在bulk RNA-seq与单细胞数据中的共同差异基因构建Tr1转录特征，并加入用于排除其他CD4谱系的负向标志，通过ScType分析患者和健康供者外周血sc-multiome数据，成功在患者样本中识别出Tr1富集簇。该簇富集于患者来源细胞，呈现TBX21、PRDM1、EOMES相关调控特征，并表达LAG3、PDCD1、GZMA、GZMB、IFNG、CD38等Tr1相关基因。该部分结果说明，Tr1特征可用于体内外周血环境中的Tr1识别与追踪。

Tr1-specific transcriptional signature identifies Tr1 cells across human solid tumors
研究进一步将Tr1转录特征应用于多种实体瘤公开单细胞数据，以检验其在组织环境中的识别能力。在透明细胞肾细胞癌（ccRCC）中，ScType识别出一个主要来源于肿瘤组织的Tr1候选簇，该簇表达BHLHE40、LAG3、PDCD1、CTLA4、PRDM1、GZMB、IFNG、IL10等，而不表达FOXP3或CXCR5。对同研究的scATAC-seq数据再分析后，也识别到具有TBX21、MAF、BATF、IRF4基序开放特征、且缺乏TH2/TH17/TFH特征的肿瘤Tr1候选簇。于结直肠癌（CRC）数据集中，Tr1候选簇主要来源于微卫星不稳定（MSI）肿瘤患者，并表达BHLHE40、LAG3、PDCD1、CTLA4、PRDM1、VDR、GZMB、IFNG及MAF等。于三阴性乳腺癌（TNBC）中，Tr1候选簇存在于肿瘤及胸壁样本中，表达BHLHE40、LAG3、PDCD1、CTLA4、PRDM1、IFNG、CCL5、CD38、TIGIT、RBPJ和MAF。研究还分析了这些数据集的TCR信息，发现Tr1簇普遍位列克隆扩增最显著的簇之一，提示其可能在肿瘤微环境中经历抗原驱动扩增。该部分结果支持Tr1特征在多种人实体瘤中识别具有Tr1表型细胞的可行性。

Tr1-specific transcriptional signature identifies murine Tr1 cells in a solid tumor model
为进一步验证Tr1特征的生物学真实性，研究人员重分析了既往报道的小鼠肉瘤模型单细胞数据。该模型中，高剂量新抗原疫苗而非低剂量疫苗可在体内诱导抑制性Tr1细胞。分析结果显示，人Tr1转录特征在一个特定小鼠细胞簇中富集最强，该簇绝大多数来自高剂量新抗原疫苗组，并高表达Lag3、Ccl5、Cxcr6、Maf、Pdcd1、Ctla4、Ifng、Gzmk、Nfil3及小鼠Tr1标志Lilrb4。该结果表明，人Tr1特征具有跨物种识别能力，能够识别体内新抗原诱导形成的真正Tr1细胞。

讨论部分指出，本研究系统补全了人Tr1细胞在表观遗传与转录调控层面的基础图谱，并通过功能实验明确IRF4、BATF和MAF在Tr1分化、表型与功能中的重要且相对非冗余作用。与小鼠IL-27驱动模型不同，人Tr1更偏IL-10驱动，本研究因此为人Tr1细胞调控框架提供了更直接证据。研究同时强调，Tr1与活化FOXP3⁺ Treg之间既有共享程序，也存在可区分的特异模块，这有助于精细理解不同免疫抑制性CD4⁺ T细胞亚群。更重要的是，研究建立的Tr1转录特征为在组织、尤其是肿瘤微环境中识别Tr1提供了工具，有助于解释为何单纯靶向FOXP3⁺ Treg的策略在某些肿瘤中可能不足。论文也指出局限性，包括scATAC批次校正效果有限、体内Tr1预测仍需更多功能验证，以及Tr1与TH1、TFH、Tph等细胞存在部分重叠特征，故应用该特征时需结合严格注释与非CD4细胞排除。

研究结论可译为：总之，本研究揭示了人抗原特异性Tr1细胞的表观遗传图谱、其关键转录调控因子IRF4、BATF和MAF，以及其转录特征。该特征能够在体内人外周血以及人和小鼠肿瘤驻留CD4⁺ T细胞中检测具有Tr1特征的细胞。因此，本研究阐明了Tr1细胞生物学中的两个关键挑战：其转录调控机制与其细胞鉴定问题。上述数据可用于通过转录因子工程开发Tr1细胞治疗，设计利用靶向转录因子降解策略在体内抑制Tr1分化的方法，并作为Tr1细胞机制研究的基础。总体而言，该研究将推进对Tr1细胞在健康与疾病中作用的理解。