钡离子感知与电压传感器状态和调节亚基相关的电压门控K+通道的细微孔道变化

《SCIENCE ADVANCES》：Barium senses subtle pore changes in a voltage-gated K+ channel associated with voltage sensor states and regulatory subunits

　　

在电压依赖性通道激活的经典模型中，孔道仅在电压传感器结构域（VSDs）以“全或无”方式激活后才会开放。VSD是否改变开放孔道的特性仍不清楚。在此，研究人员使用钡离子（Ba²⁺）阻断作为探针，研究了KCNQ1通道孔道相对于VSD和位于孔道外的调节亚基的特性。研究人员发现，KCNQ1通道的外部Ba²⁺阻断具有电压依赖性，且Ba²⁺中电压依赖性的通道开放主要源于电压依赖性的Ba²⁺解阻断。由Ba²⁺解阻断的电压依赖性所指示的开放孔道构象变化，随VSD状态、VSD-孔道耦合的改变以及与调节性KCNE亚基的结合而变化。与经典观点相反，研究人员的结果表明，KCNQ1的孔道并非独立于电压门控机制，而是灵活的，并受到电压传感器状态的细微变化以及孔道外部环境的影响。

**研究背景、问题与意义**
电压门控K⁺、Na⁺和Ca²⁺（KV、NaV和CaV）通道通过产生动作电位，在神经元、心肌细胞和肌肉细胞的功能中起核心作用，并调控几乎所有细胞类型的膜电位和离子稳态。这些通道由四个亚基（KV）或结构域（NaV和CaV）组成，中心孔道由四个亚基或结构域的跨膜螺旋S5和S6形成，周围环绕着由S1至S4构成的四个电压传感器结构域（VSD）。在电压依赖性激活中，膜去极化触发VSD构象变化，进而通过VSD-孔道耦合（即机电耦合）推动孔道开放。霍奇金和赫胥黎的经典模型认为，孔道以“全或无”方式由VSD激活触发开放，开放后孔道具有恒定电导，与VSD状态无关，离子电流仅随电压因电化学驱动力变化而变化，而非孔道构象变化。然而，在一些K⁺通道中观察到亚电导状态，但VSD构象是否调控这些开放孔道亚状态并不明确。KCNQ1（KV7.1）通道在心脏、大脑和多种上皮组织中表达，参与心脏动作电位复极化（与KCNE1组装形成I_Ks电流）、听力和上皮盐稳态。其突变与长QT综合征、心房颤动和耳聋相关。先前研究显示，KCNQ1具有双开放状态门控机制：VSD可被激活至中间（I）和完全激活（A）状态，分别导致快速中间开放（IO）和慢速完全激活开放（AO）状态，这两种状态表现出不同的离子通透性，表明孔道构象不同。研究人员还发现，VSD-pore耦合遵循“手肘”模型：S4-S5连接子的C端和N端以不同方式抓推孔道，使孔道在VSD不同状态下开放至不同构象。这些发现挑战了经典的全或无开放观点，提示孔道可能响应VSD的细微变化。本研究利用Ba²⁺作为K⁺类似物探针，通过检测Ba²⁺阻断的电压依赖性变化，进一步探究KCNQ1通道孔道构象如何随VSD状态、VSD-孔道耦合改变以及调节亚基KCNE的结合而变化。论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。

**主要关键技术与方法**
研究人员利用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞（购自美国模式培养物保藏中心）和非洲爪蟾卵母细胞（通过剖腹术取自野生型非洲爪蟾，由华盛顿大学动物研究委员会批准，协议编号20190030）异源表达系统，采用全细胞膜片钳记录（CHO细胞）和双电极电压钳（TEVC）记录（卵母细胞）测量电流；利用电压钳荧光测量（VCF）技术在KCNQ1-psWT（C214A/G219C/C331A）上同步记录VSD运动（荧光信号）和孔道开放（离子电流）；通过定点诱变构建突变体（如E1R/R2E、F0R/Q3E/D202N、E1R/R4E、F351A、S338F、R231W）及与KCNE1或KCNE3共表达，研究不同VSD状态和调节亚基的影响；分析Ba²⁺阻断的电压依赖性，包括抑制分数、G-V关系、激活和失活动力学。

**研究结果**
**Barium produces a voltage-dependent pore block and alters channel opening in KCNQ1**
通过CHO细胞记录，外部Ba²⁺（0.2 mM）对野生型KCNQ1产生浓度和电压依赖性阻断，去极化时阻断减弱，半抑制浓度（IC₅₀）随膜电位升高而增加，存在未阻断组分。Ba²⁺使稳态电导-电压（G-V）关系右移，斜率变缓，半激活电压（V_1/2）从-29.5 mV变为5.6 mV，且缓慢激活动力学和抑制失活均呈浓度依赖性。

**Barium alters pore opening by voltage-dependent block**
在爪蟾卵母细胞中，外部Ba²⁺（2 mM）同样产生电压依赖性阻断，并使G-V右移。电压钳荧光测量显示，Ba²⁺不改变VSD两步激活的电压依赖性（F1-V和F2-V组分），说明Ba²⁺不影响VSD运动。对突变体E1R/R2E（锁定VSD于中间I状态，通道持续开放于IO状态）施加Ba²⁺后，通道开放变为时间和电压依赖性，出现尾电流，且VCF未检测到荧光变化，证明电压依赖性开放完全源于Ba²⁺的电压依赖性解阻断和重新阻断。建立最小模型（图3J），表明在Ba²⁺存在下，KCNQ1的电压依赖性开闭主要由Ba²⁺阻断的电压依赖性驱动。

**The voltage dependence of Ba²⁺ block varies with VSD states and KCNE subunits**
对多种持续开放突变体（F0R/Q3E/D202N，锁定I状态；E1R/R4E，锁定完全激活A状态；E1R/R4E+KCNE1；以及KCNQ1+KCNE3）施加Ba²⁺，所有通道均转变为电压和时间依赖性电流，但G-V关系、V_1/2、激活时间常数（τ-fast和τ-slow）和尾电流时间常数在不同突变体间差异显著，无一致模式。进一步分析主要开放至IO的通道（WT、S338F、F0R/Q3E/D202N、E1R/R2E、KCNQ1+KCNE3）和主要开放至AO的通道（I_Ks、F351A、E1R/R4E、E1R/R4E+KCNE1），Ba²⁺抑制分数随电压的变化也各不相同，且与突变或KCNE亚基关联特异性相关。在CHO细胞中，对E1R/R2E、R231W和F0R/Q3E/D202N持续开放突变体施加2 mM Ba²⁺（2 mM外K⁺溶液），同样观察到电压依赖性阻断和不同的V_1/2值（分别为16.6、5.6和-3.7 mV）。改变外K⁺浓度（5-30 mM），E1R/R2E和E1R/R4E的G-V关系V_1/2随[K⁺]_o对数线性增加，斜率相似但截距不同，提示VSD突变改变了Ba²⁺与通道的内在结合自由能。反转电位测量未发现K⁺积累。

**总结讨论与结论**
讨论部分指出，Ba²⁺作为K⁺类似物，其离子半径（1.35 ?）接近K⁺（1.33 ?），在细菌KcsA K⁺通道中，Ba²⁺结合于选择性过滤器（SF）的P4和P2位点，阻断K⁺传导。本研究中KCNQ1的Ba²⁺阻断显示两个结合位点（-30至0 mV），去极化时亲和力降低，解阻断动力学拟合双指数。Ba²⁺不影响VSD运动，但Ba²⁺阻断的电压依赖性随VSD状态、VSD-孔道耦合和KCNE亚基结合而变化，表明开放孔道构象在这些条件下发生改变。这种柔性SF构象变化可能源于VSD激活状态通过VSD-S4S5连接子-S5S6段-SF轨迹的变构耦合。虽然单通道电导在IO和AO状态相似（~0.18 pS），但Ba²⁺亲和力差异反映了SF的细微构象差异。这些结果挑战了经典全或无开放观点，揭示了电压传感器状态可微调孔道通透特性。
**研究结论**（翻译原文Discussion最后一段）：总的来说，研究人员的结果表明，Ba²⁺不仅作为孔道阻断剂，还充当了卓越的传感器，能够区分因KCNQ1突变或KCNE亚基结合导致的不同VSD激活状态耦合而产生的柔性SF细微构象变化。