由卡因酸诱导的癫痫状态后小鼠海马体中DNA损伤的原位检测

《Acta Histochemica》：In situ detection of DNA damage in the mouse hippocampus following status epilepticus induced by kainic acid

　　

周成梅|李静怡|霍德生|张延峰|李燕超

中国吉林省吉林市130021，吉林大学白求恩医学中心基础医学科学学院组织学与胚胎学系

摘要

本研究采用三种互补的原位技术——PANT、Klenow和TUNEL——并结合氟玉红B（FJB）染色，检测癫痫持续状态（SE）后易受损海马神经元的DNA损伤动态变化。通过脑室内注射卡尼酸诱发SE，6小时后即出现由PANT和Klenow技术可检测到的单链断裂（ssDNA）等早期氧化性DNA损伤。16小时时ssDNA标记强度短暂下降，表明在不可逆变性之前的潜伏期可能激活了DNA修复机制。从第1天起，DNA损伤加剧，PANT和Klenow信号再次出现，且与神经元死亡增加的时间相吻合。TUNEL技术可检测双链DNA（dsDNA）断裂，其信号强度始终低于PANT/Klenow，但时间变化趋势相似。从定量上看，PANT对早期ssDNA损伤（6–16小时）的敏感性更高，而在后期（1–7天），PANT和Klenow的敏感性相当，反映出DNA碎片化程度逐渐加重。从SE发生后第3天起，DNA损伤信号与FJB染色结果相互印证，体现了DNA损伤从可逆性向不可逆性神经退行的转变。值得注意的是，由于TUNEL能检测非凋亡性的3′–OH末端，其特异性较低，因此检测效率也低于针对ssDNA的方法。这些发现表明，SE引起的DNA损伤是一个动态连续的过程——从早期ssDNA断裂到后期dsDNA碎片化——这一过程推动了神经元死亡的延迟发生，为了解癫痫损伤后的神经退行机制提供了形态学依据。

引言

癫痫持续状态（SE）是一种严重的神经系统疾病，其特征是持续性癫痫发作，会引发一系列分子和细胞层面的反应，最终导致神经元损伤（Roopra等人，2012）。这种损伤的主要机制是兴奋毒性，主要由过量的谷氨酸释放引起。离子型及代谢型谷氨酸受体的过度激活会导致钙离子异常涌入神经元（Chapman，1998）。细胞内钙离子水平持续升高会促使活性氧生成，进而造成氧化性DNA损伤（Coyle和Puttfarcken，1993）。当这种损伤较为严重，超出细胞自我修复的能力时，就会激活程序性细胞死亡途径，最终导致内切酶介导的DNA片段化及神经元死亡（Chen等人，1997）。

包括单链（ssDNA）和双链（dsDNA）断裂在内的DNA链断裂，是癫痫发作常见的后果（Lan等人，2000）。为了在原位检测这些损伤，人们开发了多种技术，每种技术都有其独特的检测特性。这些技术包括DNA聚合酶I介导的生物素-dATP缺口翻译法（PANT）、Klenow片段介导的生物素-dATP缺口末端标记法（Klenow），以及端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL；图1）。PANT测定利用DNA聚合酶I的多功能特性——包括5′→3′聚合酶功能和外切酶功能——能够检测从单碱基损伤到较大单链缺口等多种类型的损伤（Clark等人，2001；Lehman等人，1958）。相比之下，Klenow片段是缺乏5′→3′外切酶活性的DNA聚合酶I的产物，主要用于检测单链断裂和隐匿的3′–OH末端（Chen等人，1997；Clark等人，2001）。TUNEL方法则利用端脱氧核苷酸转移酶（TdT）标记游离的3′–OH末端，通常用作凋亡的标志物，但也能检测各种双链及平末端DNA断裂（Clark等人，2001；Kabakov和Gabai，2018；Moore等人，1998）。

尽管这些技术已经十分成熟，但目前仍缺乏将这三种方法结合起来系统分析SE后易受损脑区DNA损伤时空动态变化的研究。因此，SE发生后早期DNA损伤的具体性质及发展进程——这对于理解神经元延迟死亡的发生机制至关重要——至今仍不明确。海马CA3区域对SE引起的损伤尤为敏感，但目前还缺乏关于该区域从初始单碱基改变到双链断裂的详细DNA损伤时间线研究。

为填补这一空白，本研究首次结合使用PANT、Klenow和TUNEL三种技术，系统分析卡尼酸诱发SE后海马CA3区域DNA损伤的种类及发展进程。通过将这些检测结果与氟玉红B（FJB）染色所评估的神经元退行情况相结合，我们旨在建立DNA损伤进展与随后神经元死亡之间的直接联系，从而为揭示SE诱发神经毒性的机制提供新的见解。

章节节选

SE的动物模型

本实验共使用了90只ICR小鼠（20–24克，雄性；辽宁长盛生物科技有限公司提供），实验按照吉林大学动物委员会制定的方案进行（批准号：SYXK(Ji) 2023–0010）。根据相关文献中的方法（Streng等人，2021），通过向右侧脑室注射卡尼酸来建立小鼠癫痫模型。卡尼酸诱发SE的评估则是依据改良的Racine分级标准进行的

行为观察

通过脑室内注射卡尼酸，75只小鼠中有50只成功出现了癫痫发作（成功率为66.7%）。这些小鼠的癫痫发作程度逐渐加重，表现为点头、流涎、面部痉挛、类似湿狗样的震颤以及前肢强直性抽搐。为确保实验数据的可靠性，后续分析仅纳入那些发作等级≥3级、发作持续时间≥2小时（采用改良的Racine评分标准）且术后生理状态稳定的小鼠。

FJB染色

FJB是荧光素的阴离子衍生物

讨论

FJB染色的大量实验证据表明，SE发生后的最初24小时是海马CA3区域出现不可逆神经元损伤的关键时期（Weng等人，2020）。然而，即便在FJB无法检测到明显细胞死亡的情况下，潜伏期内也可能已经启动了一系列分子和细胞层面的反应。

为评估SE对神经元DNA完整性的影响，我们采用了三种原位标记技术——PANT、Klenow以及

伦理审批

本实验已获得吉林大学动物研究委员会的批准（批准编号：SYXK (Ji) 2022–0015），并且实验操作完全遵循美国国家卫生研究院关于实验室动物护理与使用的指南。

资金支持

本研究得到了中国吉林省科学技术厅自然科学基金的支持（项目编号：YDZJ202401169ZYTS）。

CRediT作者贡献说明

周成梅：研究设计、数据整理、正式分析、初稿撰写。李静怡：研究设计、数据整理。霍德生：软件应用、正式分析。张延峰：概念构思、论文审阅与编辑。李燕超：研究设计、方法学研究、数据整理、论文审阅与编辑、资金筹集。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。