《Microbiology Spectrum》：Non-destructive label-free automated identification of bacterial colonies at the species level directly on agar media using digital holography and convolutional neural network algorithms
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本研究旨在建立一种创新的、全自动、无损且无标记的细菌菌落直接识别方法，将数字全息成像与人工智能相结合，并评估其性能。研究人员在半透明脑心浸液琼脂平板上培养单个细菌菌落，在18 h培养期间每30 min采集一次高分辨率全息图像（每个整板约530 MPx）。成像系
本研究旨在建立一种创新的、全自动、无损且无标记的细菌菌落直接识别方法，将数字全息成像与人工智能相结合，并评估其性能。研究人员在半透明脑心浸液琼脂平板上培养单个细菌菌落，在18 h培养期间每30 min采集一次高分辨率全息图像（每个整板约530 MPx）。成像系统采用大视场1×放大光学配置、部分相干LED光源和高分辨率互补金属氧化物半导体（CMOS）传感器。研究人员使用来自276株临床菌株、属于10种常见致病菌的49,490张数字全息图训练卷积神经网络（CNN）。通过整合不同系统发育层级的信息进一步提高预测精度。BAIO-DX系统在训练集中10种菌的232株独立样本上，于菌种水平识别出86.6%，阳性一致率（PPA）为96.5%；对于训练集中未包含的64株、8个物种样本，还可将其中48%在属水平正确归类。结果验证了该方法作为临床微生物实验室中全自动、无损、无标记细菌鉴定方案的可行性。
本研究建立并验证了一种直接在琼脂平板上进行细菌菌落鉴定的全自动、无损、无标记系统（BAIO-DX）。研究背景在于，临床细菌学长期依赖手工、耗时且劳动密集的培养法，尽管基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）和微生物实验室自动化（MLA）显著提升了效率，但菌落挑取、图像判读和夜间值守仍高度依赖人工，且在资源受限地区可及性有限。因此，开展一种无需人工干预、可直接从琼脂平板完成物种鉴定的方法具有明确的临床和流程学价值。
研究人员的核心思路是将数字在线全息（DIH）与CNN结合。与传统二维菌落成像不同，数字全息能够捕获与菌落厚度、折射率和内部结构相关的相位信息，从而提供更丰富的定量特征，用于区分常规图像中外观相近的菌种。研究人员构建了BAIO-DX原型平台，以标准90 mm脑心浸液琼脂（BHI）平板为对象，建立首个全息图像数据库，训练AI模型，并以临床菌株评估其识别性能。
方法上，研究主要包括临床菌株与单菌阳性血培养样本的收集、BAIO-DX数字全息成像、菌落时间序列图像处理与AI建模，以及基于独立测试集的性能评价。研究使用的样本均为临床来源，包括前瞻性收集的单菌阳性血培养和医院菌株库中的临床菌株。系统通过机器人臂在培养过程中定时取板、成像并返回继续孵育；随后进行图像拼接、菌落分割与CNN推断，并结合系统发育层级进行阈值判定。
### 研究结果
#### Non-destructive label-free automated bacterial identification at the species level
BAIO-DX可在18 h培养过程中捕捉菌落形态与光学演变，反映出物种特异性的生长动力学和结构特征。训练集共分析了276个单菌样本、49,490个菌落图像，为模型提供了大规模数据基础。
#### The performance of the BAIO-DX system was subsequently evaluated on 232 independent isolates belonging to the 10 same species
在232株独立测试菌株中，系统有201株（86.6%）达到菌种水平鉴定，PPA为96.5%。未达到菌种阈值的31株被自动拒绝。采用系统发育引导的多层级阈值后，误分类率由9.9%降至3.5%，说明分层判定机制可减少错误归类。
#### Identification at a higher taxonomic level is possible for strains below confidence threshold at the species level
对未达到菌种阈值的31株菌，系统仍可将15株（48%）正确识别至属水平，8株（26%）至科水平，7株（23%）至目水平，1株（3%）至纲水平，且这些高阶分类均无误判，说明系统在不满足菌种置信度时仍能提供可靠的更高层级鉴定。
#### System performance on species absent from the training set
在训练集未包含的64株、9个物种样本中，系统通过系统发育阈值显著限制了错误的菌种级指派。多数样本在菌种层面被拒绝，但可在属、科或目层面得到正确归类，显示该方法对未知菌株具有一定层级泛化能力。
### 讨论与结论
研究人员指出，该研究提供了一个强有力的概念验证：高分辨率数字全息图像所反映的菌落形态学与物理化学特征，可支持临床相关细菌的准确鉴定。与现有以MALDI-TOF为代表的流程相比，BAIO-DX无需人工挑取、无需试剂，且可在18 h后实现实时识别，具有降低工作量、缩短周转时间和适配低资源实验室的潜力。系统发育分层阈值是该方法的重要优势，可在菌种级信心不足时避免误判，并保留属、科或目层面的有价值信息，这对早期抗菌治疗和抗菌药敏试验（AST）方案选择可能具有帮助。
研究人员同时强调，本研究仍处于概念验证阶段，主要限制包括训练物种数量有限、仅测试少量未见物种、仅适用于透明培养基、仅评估需氧条件，且尚未测试混合样本和多中心泛化能力。未来工作需扩展参考数据库、缩短检测时间、纳入更多临床相关物种，并探索与革兰染色、常规平板成像或选择性/显色培养基结合的多模态策略。总体而言，该研究证明了基于数字全息与CNN的全自动无损细菌鉴定在临床微生物学中的可行性与应用前景。
