密度梯度分离技术可揭示红点鲑活动精子中的脂质成分变化，从而提升其经冷冻保存后的受精能力

《Aquaculture》：Density gradient sorting reveals lipid composition alterations in the motile sperm fraction and improves fertilising ability after cryopreservation in sterlet Acipenser ruthenus

　　阿莱什·托姆恰拉|阿纳托利·索特尼科夫|维多利亚·兹尤巴|费利佩·马丁内斯·帕斯托尔|兹德涅卡·马霍娃|拉德克·格鲍尔|扬·姆拉兹|鲍里斯·兹尤巴捷克共和国切尔斯克布杰约维采南波希米亚大学水产与水域保护学院、水生生物多样性研究所以及水产与水域保护研究所摘要鲟鱼精子的冷冻保存是水产养殖和物种保护领域具有前景的技术；然而，由于目前对冷冻损伤如何影响经过冷冻和解冻后仍保持功能正常的精子了解不足，该技术的优化进展受限。以往的大多数研究都集中在解冻后的完整样本上，这可能掩盖了那些在具有活动能力的精子中依然存在的冷冻保存引发的改变。在本研究中，我们探讨了冷冻保存以及解冻后使用Percoll密度梯度离心法选择性分离活动能力强的精子，对这些精子运动参数、膜脂成分以及受精能力的影响，研究对象为欧洲鲟（Acipenser ruthenus）。精子活动能力通过计算机辅助精子分析技术进行评估，精子亚群则通过聚类分析来识别，而膜脂类别和脂肪酸则分别通过薄层色谱法和气相色谱法进行分析。冷冻保存降低了活动能力强精子的比例，而Percoll离心法则能在冷冻前后有效分离出具有活动能力的精子群体。无论经过何种处理，这些活动能力强精子的运动特性基本保持不变，这说明Percoll离心法主要是去除了那些没有活动能力或受损严重的细胞，而非改变了它们的游动行为。相比之下，冷冻保存导致了精子膜脂类别和脂肪酸组成的显著变化，而这些变化在解冻后具有活动能力的精子中依然存在。尽管存在这种脂质结构的变化，但经过Percoll离心法筛选的冷冻保存精子仍表现出更高的受精成功率、更好的胚胎发育状况以及更优质的幼体。据我们所知，这是首次在鱼类研究中证明，冷冻保存所导致的脂质类别和脂肪酸组成变化会存在于具有活动能力的精子中，同时解冻后的精子分离技术能够提升受精能力，还能降低后代出现由冷冻保存引发的发育异常的风险。引言鲟鱼（鲟科）属于极度濒危的鱼类群体，其主要原因是过度捕捞以及人类活动导致的产卵栖息地破坏。尽管保护工作不断加强，鲟鱼种群数量仍在持续下降，这凸显出亟需采取更为有力且协调的保护措施（Congiu等人，2023a）。与此同时，市场对鲟鱼产品尤其是鱼子酱的需求不断上升，推动了全球鲟鱼养殖业的快速发展。然而，这样的发展速度仍不足以杜绝非法捕猎行为（Congiu等人，2023b），而且如果不加以妥善管理，养殖业还可能进一步威胁到本已较为稀少的野生鲟鱼种群的生物多样性（White等人，2022）。长期储存（冷冻保存）雄性配子被视为鱼类生物多样性保护领域一种具有前景但尚未得到充分应用的手段，无论是在水产养殖还是物种保护工作中都有应用潜力（Martínez-Páramo等人，2017）。鲟鱼精子冷冻保存技术的发展历史相对较长（Billard等人，2004），但目前大多采用经验主义方法，即根据实际经验或先例来确定冷冻稀释剂以及冷冻/解冻速率，而非基于理论依据。有研究显示，即便冷冻稀释剂的成分和冷冻/解冻速率有所不同，但只要基于解冻后精子的活动能力和受精能力来判断，就能获得不错的效果（Horváth等人，2008b；Judycka等人，2015；Krasilnikova等人，2025；Mirzoyan等人，2006）。不过，冷冻保存的成功率会因物种不同（Krasilnikova等人，2025）或单个雄性精子的质量参数不同（Dzyuba等人，2012）而有所差异，这是因为不同鱼类种类的精子耐冻性存在差异（Kopeika和Kopeika，2008）。不过，根据冷冻生物学的通用原则，即需要开发针对不同细胞类型的专用冷冻稀释剂，并确定最优的冷冻/解冻速率，以此将冷冻损伤降到最低（Fuller等人，2004；Watson和Holt，2001），显然，了解精子耐冻性在种内和种间存在差异的原因，对于实现鲟鱼精子冷冻保存技术的实际应用具有重要意义。已知膜脂成分是决定精子在冷冻保存过程中能否抵御多种损害因素、从而保持完整性以保障受精成功的重要参数（Suo等人，2024）。正因如此，人们才开展了鱼类精子脂质组学研究，也尝试通过修改精子膜脂成分来提高精子的耐冻性（Müller等人，2008；Zhu等人，2023）。尽管这些研究具有很高的科学价值，但目前仍需进一步拓展，才能得出更可靠的结论，并将其应用于实际的冷冻保存工作中。关于鲟鱼精子脂质成分的研究资料极为有限（Engel等人，2020），尤其是在与冷冻保存相关的研究方面（Drahan等人，2018）。不过，由于脂质过氧化过程与膜脂成分之间存在明显的关联（Duché和Sanderson，2024），目前有关鲟鱼精子抗氧化系统以及添加抗氧化剂对精子冷冻保存效果影响的已有研究数据（Kolyada等人，2023b；Sandoval-Vargas等人，2021），已经足以证明精子脂质组学在鲟鱼冷冻生物学研究中的重要性。值得注意的是，迄今为止，大多数关于鱼类精子冷冻保存的代谢和生理学研究都是针对完整精子样本进行的。这种方法存在低估冷冻损伤风险的弊端，因为冷冻保存会导致精子中出现不同程度受损的亚群。因此，那些因冷冻保存而严重受损或完全被破坏的细胞的存在，可能会掩盖那些存活下来且仍保持良好活动能力和受精潜力的细胞的真实受损伤程度。例如，在鲟鱼研究中，蛋白质组学比较显示，新鲜精子与冷冻精子之间存在显著差异，但当将新鲜精子与通过Percoll离心法从冷冻精子中分离出的高活动能力精子亚群进行比较时，这两种精子之间的差异就变得微不足道了（Horokhovatskyi等人，2018）。这些研究结果进一步强调了有必要深入了解冷冻保存对精子生化及生理参数的实际影响，尤其是那些在冷冻保存后仍然存活的精子亚群。不过，目前尚不清楚冷冻保存是否会导致那些在冷冻后仍具有活动能力、功能正常的精子中膜脂成分发生改变。由于整体样本的分析无法反映与受精相关的精子亚群的生化状态，因此那些耐冻精子中脂质成分变化的真实程度和性质至今仍未明确。迄今为止，还没有任何研究专门分析过鲟鱼或其他鱼类解冻后具有活动能力的精子亚群的膜脂成分。这是一个亟待填补的研究空白，因为这一亚群直接决定了受精的成功率，因此也是改进冷冻保存技术方案在生物学和实际应用层面上的重要目标。了解与冷冻保存相关的精子膜脂特征，对于鲟鱼的水产养殖和物种保护工作具有重要的现实意义。尤其是，明确解冻后具有活动能力的精子亚群的生化特征，有助于研发出新的冷冻保存介质，这类介质可加入能够稳定膜脂并维持膜完整性的添加剂。这样的方法有助于优化孵化场中使用的冷冻保存技术，提高亲鱼管理的受精成功率，同时增强种质库的可靠性，而种质库对于商业生产以及物种恢复计划而言都至关重要。由于冷冻保存会导致不同解冻后的精子亚群受到不同程度的损伤，我们推测，那些在冷冻保存后仍保持高活动能力的精子，其膜脂成分的变化程度会比整个解冻后的精子群体更轻，而这种保持稳定的脂质成分正是它们具备更强受精能力的原因。为了验证这一假设，本研究旨在探讨冷冻保存对经过筛选出的高活动能力精子亚群膜脂成分的影响，并评估这一亚群的受精能力。章节节选伦理声明所有涉及鱼类的饲养和操作均获得了南波希米亚大学机构动物护理与使用委员会的批准，该批准是基于该委员会颁发的用于饲养和提供实验动物的许可文件（编号：64155/2020-MZE-18134），以及捷克共和国农业部授予南波希米亚大学水产与水域保护学院的实验动物使用许可文件（编号：68763/2020-MZE-18134）。精子活动能力百分比在所有分析的精子活动能力指标中，MOT在激活后的整个时间段内显示出最明显且最一致的差异效应。各实验组平均MOT的时间变化曲线如图2所示。双向方差分析所得的F值和p值详细数据见补充表ST1–1。根据这些结果，可以划分出两个不同的时间阶段。在早期和中期活动能力阶段（15–98秒，区间A，图2），CRYO组和DGC组的数值均有明显差异。总体考虑本研究表明，通过Percoll密度梯度离心法从冷冻保存的欧洲鲟精液中分离出的高活动能力精子，其运动参数与天然精子的运动参数极为相似。不过据我们所知，这是首次有研究证明，尽管这些精子的活动能力得以保留，但与新鲜精子相比，它们的膜脂类别和脂肪酸组成却存在明显变化。因此，我们的初步研究结果……结论本研究表明，冷冻保存会导致精子膜脂成分发生改变，而这些变化会存在于那些具有活动能力、功能正常的精子中，这表明即使精子的生化结构发生了显著变化，其受精能力依然可以得以保持。这些发现为理解鱼类精子中膜脂重组与功能性耐冻性之间的关系提供了新的见解，同时也表明，要维持精子的受精能力，未必需要保持其原有的生化结构。关于手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明在撰写本手稿的过程中，作者们使用了Microsoft 365 Copilot工具来优化语言表达，提升文本的可读性，以便更广泛的读者群体能够理解。所有通过该工具生成的内容都经过了作者们的仔细审核和修改，最终发表的文章内容完全由作者们负责。CRediT作者贡献说明阿莱什·托姆恰拉：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，验证，方法学，研究实施，正式分析，数据整理。阿纳托利·索特尼科夫：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，验证，方法学，研究实施，正式分析，数据整理。维多利亚·兹尤巴：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，研究实施，正式分析。费利佩·马丁内斯·帕斯托尔：写作——审阅与编辑，验证，软件应用，正式分析，数据整理。伦理声明所有实验操作均遵循南波希米亚大学水产与水域保护学院、鱼类养殖与水生生物学研究所的机构动物护理与使用委员会制定的准则，这些准则是以捷克共和国的欧盟统一动物福利法规为依据的。不过，鉴于本研究涉及的物种特点，这些地点和实验活动并不需要额外的特殊许可。资金支持本研究得到了捷克科学基金会的资助（编号：GACR 22–14069S）。部分研究工作还得到了VVI CENAKVA研究基础设施的支持（编号：90238，MEYS CR，2023–2026年）。未引用参考文献Kolyada等人，2023a利益冲突声明作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。致谢本研究得到了捷克科学基金会的资助（编号：GACR 22-14069S）。部分研究工作还得到了VVI CENAKVA研究基础设施的支持（编号：90238，MEYS CR，2023–2026年）。