靶向ROAM1的UDP-GlcNAc纳米片选择性激活溶酶体AMPK以改善代谢功能障碍相关脂肪性肝病

《Bioactive Materials》：Targeting ROAM1 with UDP-GlcNAc nanosheets selective activates lysosomal AMPK to resolve metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease

　　

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）是一种普遍存在的慢性肝病，治疗选择有限。尽管AMP活化蛋白激酶（AMPK）已涉及多种病理过程，并被认为是MASLD极具前景的治疗靶点，但AMPK激活剂的临床疗效并不理想，这可能是由于AMPK的底物过于丰富以及激活机制复杂所致。近期关于溶酶体特异性激活AMPK的研究揭示了其对代谢底物激活的偏好性，将其视为MASLD精准治疗的潜在靶点。在此，通过基于双分子荧光互补（BiFC）的蛋白质相互作用筛选，研究人员鉴定出核苷酸-糖转运蛋白ROAM1（由SLC35F6重新命名）是一种定位于溶酶体并与AMPKβ相互作用的蛋白质，负向调节AMPK活性。在小鼠肝脏和肌肉中沉默ROAM1可提高基础AMPK活性，并诱导抑制脂质合成的转录状态。UDP-GlcNAc是ROAM1的配体，通过ROAM1-AMPKβ轴激活溶酶体AMPK，主要调节脂质代谢。为了评估该通路对MASLD的治疗效果，研究人员设计了镁配位的UDP-GlcNAc纳米片（MgUGN）以实现高效的体内递送。MgUGN治疗可改善代谢疾病模型中的脂质代谢并减少肝脏脂肪变性，并通过减少炎症减轻急性损伤模型中的肝损伤。这些发现确定了UDP-GlcNAc-ROAM1-AMPK轴是肝脂质代谢的调节因子，并引入MgUGN作为一种新型的区室特异性AMPK激活剂用于肝病。

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD，曾称非酒精性脂肪性肝病，是全球流行的慢性肝病，约38%的成年人受累，且与心血管疾病和肝外恶性肿瘤密切相关。现有治疗手段有限，主要挑战在于缺乏有效的药物靶点。AMP活化蛋白激酶（AMPK，一种能量感受器）在MASLD中活性显著降低，恢复其活性可改善肝脏脂肪变性、炎症和纤维化，但传统激活剂（如A769662、AICAR）因底物广泛、激活机制复杂而临床疗效不佳。近期研究揭示溶酶体特异性AMPK激活具有底物选择性，优先调控代谢通路，为精准治疗提供新方向。然而，溶酶体AMPK的调控网络尚不完整，尤其缺乏限制其激活的内源因子。为此，研究人员开展本研究，旨在发现新的AMPK上游调控因子，开发靶向溶酶体AMPK的精准激活策略。

研究人员通过基于双分子荧光互补（BiFC，一种蛋白质相互作用检测技术）的全基因组筛选，鉴定出溶酶体蛋白ROAM1（由SLC35F6重新命名）为AMPKβ相互作用蛋白，负向调控AMPK活性。进一步研究发现，UDP-GlcNAc（尿苷二磷酸N-乙酰葡糖胺，己糖胺生物合成途径终产物）是ROAM1的天然配体，通过ROAM1-AMPKβ轴激活溶酶体AMPK，并优先磷酸化代谢相关底物（如ACC1），抑制脂质合成。为克服UDP-GlcNAc膜通透性差和代谢迅速的缺陷，研究人员设计了镁配位UDP-GlcNAc纳米片（MgUGN），实现了体内高效递送和持续释药。该研究发表在《Bioactive Materials》，阐明了UDP-GlcNAc-ROAM1-AMPK信号轴在肝脂代谢中的核心作用，并为MASLD治疗提供了新型区室特异性AMPK激活剂。

研究人员采用的关键技术方法包括：基于BiFC的全基因组蛋白质相互作用筛选（以AMPKβ1/β2为诱饵，在人ORFeome文库的HTC75细胞中进行筛选）；分子对接和分子动力学（MD）模拟预测UDP-GlcNAc与ROAM1的结合模式；通过一锅沉淀法合成镁配位UDP-GlcNAc纳米片（MgUGN），并利用透射电镜、动态光散射、X射线衍射、X射线光电子能谱和傅里叶变换红外光谱表征其结构；小鼠模型包括C57BL/6J小鼠（来源：广州Gem Pharmatech和Cyagen Biosciences，8-10周龄雄性）用于高脂饮食（HFD）诱导的脂肪肝、急性对乙酰氨基酚（APAP）肝损伤，以及ob/ob瘦素缺陷小鼠用于遗传性肥胖模型。

研究结果总结如下：

**2.1 溶酶体蛋白ROAM1与AMPKβ相互作用并直接抑制AMPK活性**：通过BiFC筛选和免疫共沉淀实验，研究人员发现ROAM1定位于溶酶体，与AMPKβ亚基特异性结合。在HEK293T和MEF细胞中，通过siRNA敲低ROAM1或CRISPR介导的敲除均显著增加AMPKα Thr172位点和ACC Ser79位点的磷酸化，且该效应不依赖AMP/ATP比值变化，也不依赖线粒体膜电位改变，表明ROAM1以一种绕过AMP感知的方式负调控AMPK。

**2.2 ROAM1下调诱导的AMPK激活在体外和体内均减少脂肪合成**：在AML12肝细胞中，ROAM1敲低显著增加ACC磷酸化、减少脂滴，并下调脂肪酸合酶（Fasn）和转录因子Srebp1c的mRNA表达，上调脂解酶Atgl和Hsl的表达；同时降低甘油三酯和丙二酰辅酶A水平。AMPK抑制剂BAY-3827可逆转这些变化。小鼠肝脏和肌肉局部注射siROAM1后，同样观察到AMPK和ACC磷酸化升高、脂质合成基因下调及脂解基因上调，甘油三酯和丙二酰辅酶A降低。

**2.3 UDP-GlcNAc是ROAM1的配体且为新型AMPK激活剂**：分子对接和MD模拟显示，UDP-GlcNAc与ROAM1跨膜区以约0.35 nm RMSD的稳定结合。在细胞裂解液中，仅UDP-GlcNAc在低毫摩尔浓度下诱导AMPK磷酸化；通过电穿孔将UDP-GlcNAc导入细胞，或使用葡糖胺（GlcN，通过己糖胺生物合成途径提高UDP-GlcNAc）处理，均可增强AMPK和ACC磷酸化，且不改变AMP/ATP比值。敲低UAP1（HBP终末酶）阻断GlcN的作用，证实了UDP-GlcNAc的特异性。该过程不依赖O-GlcNAc糖基化或高渗应激。

**2.4 UDP-GlcNAc通过ROAM1激活AMPK**：ROAM1敲除或敲低细胞中，UDP-GlcNAc无法激活AMPK，而AICAR、H2O2和葡萄糖饥饿仍有效。ROAM1跨膜结构域缺失突变体丧失对UDP-GlcNAc的响应，C末端尾部（含溶酶体分选基序）缺失或基序突变则破坏ROAM1-AMPKβ相互作用及溶酶体定位，消除UDP-GlcNAc诱导的AMPK激活。与其他SLC35家族成员（SLC35A3、SLC35D1）不同，ROAM1特有的溶酶体定位使其唯一参与此过程。体外磷酸酶实验表明，ROAM1直接招募PP2C磷酸酶促进AMPKα脱磷酸化，而UDP-GlcNAc结合后可释放该抑制。

**2.5 UDP-GlcNAc激活溶酶体AMPK优先磷酸化代谢底物并调节脂质代谢**：在AML12细胞中分离溶酶体和线粒体组分发现，UDP-GlcNAc处理15分钟内选择性增强溶酶体AMPK及其底物RAPTOR、TSC2的磷酸化，而线粒体AMPK和底物MFF无变化。胞质中ACC1（定位于胞质）磷酸化显著增强，而ACC2（定位于线粒体）无变化。基因表达分析显示UDP-GlcNAc优先抑制脂合成基因（Srebp1c、Fasn），对脂解基因影响较小；相比于经典激活剂A769662，UDP-GlcNAc更显著减少脂滴而对线粒体裂变无影响。

**2.6 UDP-GlcNAc衍生的纳米片MgUGN实现体内研究**：通过Mg2+配位自组装形成稳定纳米片（MgUGN），直径338 nm，负电荷表面。在pH 5.5条件下6小时释放率达97.85%，适于酸性溶酶体环境。细胞摄取实验显示Cy5.5标记的MgUGN在30分钟内进入细胞，峰值持续4小时。

**2.7 MgUGN是强效AMPK激活剂并实现持续AMPK信号**：MgUGN处理HEK293T细胞1小时内诱导AMPK/ACC磷酸化，活性持续36小时，远优于游离UDP-GlcNAc。MgUGN在50-100 μg/mL剂量起效，优于AICAR和A769662。其依赖ROAM1和UAP1，且与经典激活剂（AICAR、A769662、葡萄糖饥饿）联合使用时显示协同效应。MgUGN也下调脂合成基因、增加脂解基因，减少甘油三酯和脂滴，该效应被BAY-3827逆转。

**2.8 MgUGN在不同小鼠模型中提供代谢益处和肝脏保护**：静脉注射MgUGN无全身毒性，主要富集于肝脏。在HFD喂养野生小鼠和ob/ob瘦素缺陷小鼠中，MgUGN治疗（每72 h静脉注射，10 mg/kg，14天）显著减少肝脏脂滴、降低肝重/体重比、肝脏和血浆甘油三酯、总胆固醇及LDL-C，而不影响体重和摄食。在APAP急性肝损伤模型中，提前2小时给予MgUGN可降低血清ALT/AST水平，减轻肝细胞坏死和凋亡（TUNEL染色减少），并降低TNF-α和IL-1β表达。

在讨论部分，研究人员总结了UDP-GlcNAc-ROAM1-AMPK轴的特异性调控机制：该轴通过ROAM1的支架作用将AMPK锚定于溶酶体，UDP-GlcNAc作为配体解除ROAM1与PP2C的相互作用，从而选择性激活溶酶体AMPK并优先磷酸化脂生成底物（ACC1），而非线粒体底物。这种区室化激活模式不同于传统AMPK激活剂，且与mTORC1信号通路的潜在交叉尚待研究。研究结论：UDP-GlcNAc是新型内源性AMPK激活剂，通过ROAM1介导的溶酶体激活选择性调控脂代谢；其纳米制剂MgUGN具有良好生物相容性和肝靶向性，在代谢性肝病和急性肝损伤模型中均显示治疗潜力，为MASLD的精准治疗提供了创新策略和候选药物。