神经球蛋白减少三维人神经母细胞瘤细胞培养中应激诱导的氧化损伤和淀粉样蛋白负荷

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》：Neuroglobin reduces stress-induced oxidative damage and amyloid burden in a three-dimensional human neuroblastoma cell culture

　　

神经球蛋白（Neuroglobin，Ngb）是一种在神经系统中表达的神经保护蛋白。研究人员采用悬滴法生成了Ngb过表达的SH-SY5Y球体。研究人员测试了Ngb对1-甲基-4-苯基吡啶鎓（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP⁺）毒性的影响。Ngb过表达降低了MPP⁺诱导的自噬损伤和淀粉样蛋白负荷。Ngb可能促进应激暴露下神经元蛋白质稳态的维持。

**论文解读：神经球蛋白（Ngb）在三维人神经母细胞瘤细胞培养中缓解应激诱导的氧化损伤和淀粉样蛋白负荷**

**研究背景与问题**

神经球蛋白（Neuroglobin，Ngb）是一种主要在神经系统神经元中表达的六配位血红素蛋白，近年来被广泛认为具有内源性神经保护功能。尽管其基础浓度在成年脑中仅占总蛋白的0.01%以下，但在缺氧-缺血、神经炎症、氧化应激等多种病理生理刺激下，Ngb的表达会显著上调。Ngb的细胞保护作用与其向线粒体的易位密切相关，它能通过清除活性氧（ROS）和活性氮（RNS）、与线粒体呼吸链蛋白相互作用、改善线粒体功能以及抑制内源性凋亡通路来维持神经元存活。此外，已有研究表明Ngb是自噬（macroautophagy）的正调控因子，能通过降低mTORC1（mTOR复合物1）的抑制活性来促进自噬起始。

尽管Ngb在多种二维（2D）细胞模型和动物疾病模型中的保护作用已被广泛报道，但其在三维（3D）细胞培养中的效果从未被系统分析。3D细胞培养体系比2D培养更接近体内组织微环境，能模拟细胞间通讯、细胞-基质相互作用以及代谢梯度等特征。因此，本研究旨在建立一种Ngb过表达的3D细胞模型，并评估其对1-甲基-4-苯基吡啶鎓（MPP⁺）诱导的神经毒性的抵抗能力。MPP⁺是帕金森病（PD）体外模型中常用的神经毒素，能抑制线粒体电子传递链复合物I，导致ATP耗竭、ROS增加和细胞死亡。

**研究内容与结论**

研究人员利用悬滴法生成了稳定过表达Ngb（NGB-FLAG）的人神经母细胞瘤SH-SY5Y球体，并以野生型和空载体转染的球体作为对照。通过共聚焦显微镜和免疫印迹证实了Ngb在NGB-FLAG球体中的显著高表达。随后，研究人员用不同浓度（0.5、1、2.5 mM）的MPP⁺处理球体24小时，通过流式细胞术检测ROS水平、细胞死亡（亚G1峰分析）和PARP切割，评估氧化应激和细胞凋亡。结果发现，MPP⁺显著增加了对照球体中的ROS水平和凋亡细胞比例，而Ngb过表达球体则表现出明显降低的ROS水平、更少的亚G1期细胞以及更低的PARP切割水平，证实了Ngb的抗凋亡和抗氧化作用。

进一步，研究人员分析了Ngb对自噬和淀粉样蛋白聚集的影响。通过Triton X-100可溶（TX-Sol）和不可溶（TX-Ins）组分分离及免疫印迹，检测自噬标志物LC3-II和SQSTM1/p62的水平。在对照球体中，MPP⁺处理导致TX-Sol和TX-Ins组分中LC3-II和p62显著积累，提示自噬流受损。而Ngb过表达球体中，MPP⁺诱导的LC3-II和p62在TX-Ins组分中的积累显著减少，流式细胞术也显示p62阳性细胞比例降低，表明Ngb能缓解MPP⁺引起的自噬障碍。此外，通过硫黄素-S（ThS）染色和流式细胞术评估淀粉样蛋白负荷，MPP⁺处理增加了ThS阳性细胞比例，而Ngb过表达组中ThS阳性细胞比例显著低于对照组，提示Ngb能减少应激诱导的淀粉样蛋白聚集。

该论文发表在《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》上。研究结论表明，Ngb过表达可降低MPP⁺诱导的氧化损伤，恢复自噬功能，减少淀粉样蛋白聚集，从而促进神经元存活，为Ngb在神经退行性疾病防治中的潜在应用提供了3D细胞水平的证据。

**主要关键技术方法**

本研究采用的关键技术方法包括：① 构建人Ngb与3×FLAG融合的稳定表达载体，通过脂质体转染法稳定转染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞（来源：ATCC CRL-2266）；② 利用悬滴法生成3D球体（每滴含20,000个细胞，培养3天）；③ 通过Triton X-100可溶/不可溶组分分离结合免疫印迹分析自噬标志物；④ 流式细胞术检测ROS（DCFH-DA探针）、细胞周期/凋亡（PI染色）、p62水平和淀粉样蛋白负荷（ThS染色）；⑤ 共聚焦显微镜验证Ngb表达。

**研究结果**

**2.1 Ngb过表达降低MPP⁺诱导的氧化应激和细胞死亡**

通过共聚焦显微镜和免疫印迹确认Ngb在NGB-FLAG球体中高表达后。流式细胞术检测DCF荧光显示，MPP⁺处理（0.5、1、2.5 mM，24 h）显著增加对照球体中的ROS水平，而Ngb过表达球体中ROS水平显著低于对照。PI染色分析表明，MPP⁺处理导致对照球体SubG1期细胞比例增加，而Ngb过表达球体细胞死亡率显著降低。免疫印迹检测PARP1切割也证实，MPP⁺处理后NGB-FLAG球体中cleaved PARP1水平显著低于对照，证实了Ngb的抗凋亡作用。

**2.2 Ngb过表达减轻神经毒性应激后的自噬损伤并阻止淀粉样蛋白积累**

免疫印迹分析显示，MPP⁺（0.5 mM，24 h）处理显著增加对照球体中TX-Sol和TX-Ins组分的LC3-II和p62水平，提示自噬流受损。在NGB-FLAG球体中，MPP⁺诱导的LC3-II和p62在TX-Ins组分中的积累显著低于对照，且p62阳性细胞比例也显著降低，表明Ngb能恢复自噬功能。通过ThS染色和流式细胞术，MPP⁺处理增加了ThS阳性细胞比例，而NGB-FLAG球体中该比例显著低于对照，表明Ngb能减少淀粉样蛋白聚集。

**讨论与结论**

本研究表明，3D细胞培养体系能够更真实地模拟体内组织微环境，首次建立了稳定过表达Ngb的SH-SY5Y球体模型。研究人员发现，Ngb过表达可有效抵抗MPP⁺诱导的氧化应激和凋亡，与已知的Ngb作用机制一致。更重要的是，Ngb能缓解MPP⁺引起的自噬流障碍，减少自噬体标志物（LC3-II、p62）在不可溶组分中的积累，并降低淀粉样蛋白负荷。这些结果提示，Ngb通过减少氧化损伤，维持自噬功能，清除错误折叠蛋白聚集体，从而保护神经元。研究结论部分翻译如下：

总之，研究人员通过利用三维神经母细胞瘤细胞培养，强调了Ngb在生理和病理条件下维持神经元蛋白质稳态（proteostasis）中的作用。进一步的研究将深入探讨Ngb过表达对神经退行性疾病相关蛋白质和细胞器质量控制系统改变的影响。然而，这些初步发现为在健康和疾病状态下探索Ngb生物学功能的新见解奠定了使用3D细胞培养的基础。