评估mRNA中Poly(A)尾长度的一种简单方法

《Methods and Protocols》：A Simple Method to Evaluate the Length of Poly(A) Tails in mRNA

　　

由体外转录产生的合成mRNA是已获批疫苗和许多正在开发药物的活性药物成分。它通常包含一个3' Poly(A)尾，用于优化mRNA的稳定性和翻译。产生的mRNA中Poly(A)尾的平均长度无法精确预测，因此必须使用复杂技术测量，如逆转录和测序或切割Poly(A)尾并通过毛细管电泳或质谱分析。研究人员报告了一种评估合成mRNA中平均Poly(A)尾长度的加速方法，该方法利用了噻唑橙仅在接近核酸时才具有荧光的事实。一种在两端带有噻唑橙的oligo(dT)₁₂寡核苷酸发出的荧光信号与可用Poly(A)序列的量成比例。使用已知量的Poly(A) RNA寡核苷酸制成的滴定曲线，噻唑橙oligo(dT)₁₂寡核苷酸可以立即指示mRNA样品中Poly(A)尾的平均长度。这种快速简便的方法可在任何实验室中用于确定用于研究、临床前研究和临床试验的体外转录mRNA中Poly(A)尾的大小。

**论文解读：一种评估mRNA Poly(A)尾长度的简便荧光方法**

**研究背景、问题与动机**
合成mRNA作为疫苗（如SARS-CoV-2和呼吸道合胞病毒疫苗）及多种新兴治疗药物的活性成分，其质量属性至关重要。其中，3' Poly(A)尾的长度直接影响mRNA的稳定性和翻译效率，是确保药效的关键参数。然而，无论采用DNA模板共转录加尾还是后期Poly(A)聚合酶加尾，Poly(A)尾的实际长度均无法精确预测：RNA聚合酶在同聚序列上可能提前终止，导致尾长不一；酶促加尾则受ATP浓度、酶效率、3'端可及性等因素影响，产生不均一的尾长分布。因此，在mRNA医药生产中，需对Poly(A)尾长度进行质量控制。现有方法如逆转录测序、毛细管电泳或质谱分析虽精确，但操作复杂、耗时且成本高昂，难以在普通研究实验室或个性化治疗（如每例患者定制mRNA）中推广。为此，研究人员开发了一种基于噻唑橙（thiazole orange, TO）荧光探针的简易快速方法，旨在实现普遍可及、高通量的Poly(A)尾长度评估。该研究发表于《Methods and Protocols》。

**主要关键技术方法**
研究人员设计并合成了在5'端和3'端均标记噻唑橙的寡脱氧胸苷酸探针（ECHO-53），该探针与mRNA的Poly(A)尾杂交后产生荧光。利用已知浓度的化学合成Poly(A)₆₀ RNA寡核苷酸制备标准曲线，将待测体外转录（in vitro transcription, ivt）mRNA样品（编码gaussia luciferase、firefly luciferase或mCherry，分别含0或120个A的编码模板）在磷酸盐缓冲液（PBS）中与固定量ECHO-53探针反应，通过微孔板读板仪（480 nm激发/520 nm发射）检测荧光信号。通过非线性回归拟合标准曲线，计算样品中Poly(A)含量，再根据mRNA长度（不含Poly(A)尾）换算平均Poly(A)尾长。所有mRNA由HiScribe? T7 mRNA试剂盒体外转录产生，使用CleanCap? AG加帽。质粒线性化后转录，DNA模板含A₆₀GA₆₀序列或仅含线性化后不含Poly(A)序列。

**研究结果**

**3.1 ECHO探针荧光条件的优化**
研究人员比较了仅在5'端、3'端或两端标记噻唑橙的oligo(dT)₁₂探针与递增量的Poly(A)₆₀ RNA杂交后的荧光强度。结果发现，两端标记的探针（5'+3'）产生的荧光信号最强，信噪比（有无Poly(A)时的荧光比值）达8.8，显著高于单端标记探针（约3.2-3.5）。后续实验仅使用该双标记探针，命名为ECHO-53。白色96孔板中的荧光信号比透明板高10倍。每孔100 pmol ECHO-53为最佳用量；杂交需在PBS中进行（纯水中无信号），且至少需要40 mM NaCl才能实现完全杂交。激发/发射波长480/520 nm比推荐值512/533 nm更有效。荧光信号在混合后数小时内保持稳定。最佳检测范围为7-1000 ng Poly(A)₆₀ RNA，超过1000 ng时信号饱和。

**3.2 利用ECHO探针评估生成的ivt mRNA中的Poly(A)尾长度**
使用2-250 ng Poly(A)₆₀ RNA建立标准曲线（图2A），同时检测1 μg具有不同Poly(A)编码的ivt mRNA（A0无尾，A120含120个A的模板）。结果表明，含Poly(A)序列的mRNA（A120）产生显著更高的荧光信号（图2B）。通过非线性回归将荧光值代入标准曲线，计算出每个样品中Poly(A)序列的质量（图2C）；除以mRNA质量（1000 ng）得到Poly(A)占比（图2D）；再乘以mRNA长度（不含尾：Gluc 569 nt, mCherry 723 nt, Fluc 1663 nt），得到平均Poly(A)尾长估计值（图2E）。计算出的平均尾长范围为60-100个碱基，低于模板编码的120个A，表明RNA聚合酶在同聚序列上确实存在提前终止现象，尤其是在转录过程中ATP消耗时。

**讨论与结论**
本研究开发的方法利用噻唑橙对核酸结合后荧光激发的特性，通过双标记oligo(dT)₁₂探针与mRNA Poly(A)尾杂交，实现了对平均尾长的快速估算。该法仅需标准微孔板读板仪，在数分钟内即可完成，适用于高通量筛选和常规质控，相比测序（需数天）和毛细管电泳（需专用设备）显著简化。尽管该方法提供的是平均值而非精确分布，且计算基于若干近似（如使用不含Poly(A)尾的mRNA长度），但其简便性使其尤其适用于研究实验室、临床前研究以及个性化医疗中快速、按需的质量检查。研究人员指出，未来可通过与测序数据交叉验证、优化探针长度或化学修饰来进一步提升精度和动态范围。总之，该研究填补了合成mRNA质量控制流程中的一个关键空白，为加速下一代表观转录组疗法的开发提供了实用工具。

**翻译研究结论部分**（对应原文讨论最后一段）：
总之，我们简单高效的方法填补了合成mRNA生产质量控制流程中的一个关键空白，为加速下一代mRNA治疗药物的开发提供了有价值的工具。