《Tropical Plants》：Single-cell and spatial multi-omics technologies in plants: exploring transcriptomics, proteomics, metabolomics, and emerging integrations
植物生命依赖于基因表达、蛋白质丰度和代谢活性的精确时空协调。尽管单细胞测序(single-cell sequencing)已转变了对细胞异质性的解析分辨率，但组织解离不可避免地破坏了理解细胞间通讯和局部调控环境所需的位置背景信息。空间组学(spatial omics)技术通过将分子状态直接映射到原生组织架构上，解决了这一局限性。在此，研究人员综述了从植物单细胞组学到空间分辨图谱的演进过程，重点强调了植物特有的约束条件，例如坚固的细胞壁、广泛的液泡化、细胞器RNA干扰(organellar RNA interference)以及代谢物驱动的自发荧光(metabolite-driven autofluorescence)。研究人员进一步比较了常规可部署方法与新兴概念验证方法在转录组学(transcriptomic)、蛋白质组学(proteomic)和代谢组学(metabolomic)层面上的差异，突出了在具有挑战性的植物组织中选择平台时的关键考虑因素。最后，研究人员讨论了多组学整合(multi-omics integration)的主要障碍——包括分辨率不匹配(resolution mismatch)、图像配准(image registration)和时间异步性(temporal asynchrony)——并勾勒出一条通向预测性、时空分辨的植物“数字孪生”(digital twins)的路线图，该路线图对热带物种的作物改良具有特别意义。
信号捕捉与模态特定平台（Signal capture and modality-specific platforms）
植物细胞分辨率组学现在涵盖了一系列快速扩展的技术，用于在解离的细胞、细胞核和完整组织切片中捕捉转录本、染色质状态、蛋白质和代谢物。在模态设计层面，这些平台在分子范围、空间分辨率、通量以及与发现驱动型或靶向型分析的兼容性方面各有不同。然而，在植物中，标称的平台能力并不总能直接转化为有效性能，因为分子捕捉受到组织解剖结构、生化背景和样品处理方式的强烈制约。因此，后续章节比较了主要平台类别及其分析优势，而后面一节则讨论了植物特有的制备约束条件，这些条件往往决定了这些能力在实际中能否实现。本节提供了一张综述中讨论的主要平台类别的比较概览（见表1）。
单细胞与空间转录组学（Single-cell and spatial transcriptomics）
批量RNA测序(bulk RNA sequencing)曾对研究植物生理不可或缺，但它平均了细胞群之间的信号，从而掩盖了细胞类型特异性程序。向单细胞RNA测序(scRNA-seq)的转变使得能够高分辨率地剖析细胞异质性和调控程序（图1a）。早期的实现主要依赖荧光激活细胞分选(FACS)或激光捕获显微切割(LCM)将单细胞分离到多孔板中。这些基于板的策略虽然提供了高灵敏度和全长转录本覆盖，但受限于低通量、高单细胞成本和劳动密集型流程。从技术角度看，植物scRNA-seq已在多个高通量平台上实施。所有单细胞测序平台面临的一个基本挑战是需要扩增或处理单个细胞中极微量的核酸——通常为皮克级RNA——以达到文库构建和测序所需的量。早期基于板的方法通过全长cDNA扩增策略（如Smart-seq2）解决了这一问题，提供了高灵敏度但低通量。基于微滴的平台则依赖微滴内条形码和3'端捕获来扩展通量，但以牺牲单细胞灵敏度为代价。
基于微滴的系统，如10x Genomics Chromium和华大基因的DNBelab C系列，已实现了对数万个细胞的可扩展分析，促进了多领域植物研究。单细胞技术的首个主要应用是构建细胞图谱，从而了解不同细胞簇的细胞组成和转录组特征。除了对细胞类型进行分类，这些研究还重塑了对植物组织的理解，将其视为由连续转录状态而非固定身份构成的动态系统。在拟南芥根和保卫细胞谱系中，sc转录组学解析了中间状态和发育分支点。同样，在病原体感染的叶片中，细胞分辨率分析揭示了免疫激活并非均匀分布，而是涉及临近细胞群体间高度选择性和上下文依赖的反应。在代谢系统中，sc方法进一步证明，特定生物合成程序通常局限于特定细胞生态位，为将转录调控与组织功能联系提供了更机制性的框架。在热带作物中，sc图谱已开始揭示批量方法无法解析的组织特异性细胞异质性：例如在木薯叶片中，发育和生理专业化分布在不同表皮、叶肉和维管细胞群体中；而在香蕉根尖，单细胞转录组学揭示了根发育的细胞命运决定程序。
空间转录组学(ST)将转录组测序扩展到完整组织背景，使得原则上可以重建解离过程中丢失的空间梯度和组织程序。虽然scRNA-seq/snRNA-seq以高分辨率解析了细胞异质性，但它需要组织解离，从而移除了对解释植物细胞命运和功能至关重要的位置信息（图1b）。当前ST技术大致可分为三类：基于捕捉的NGS平台、基于成像的转录本映射（例如多重荧光原位杂交(multiplexed FISH)），以及基于显微切割的方法（例如LCM），其中从组织学定义的目标区域(ROI)中测序RNA。NGS平台通常是全转录组范围和发现驱动的，目前实践中常是跨组织和跨条件构建图谱规模映射的最合适选择；然而，每个空间单元有限的转录本捕捉以及斑点/区域分辨率限制可能降低灵敏度并混合来自多个细胞的信号，常需用scRNA-seq/snRNA-seq参考进行计算解卷积(deconvolution)。成像平台可实现细胞到亚细胞水平的定位，但由于靶向基因面板和密集成像流程，通常通量较低且可扩展性较差。显微切割策略提供灵活的ROI选择并与标准RNA-seq兼容，但其有效空间分辨率和通量受ROI大小和采样工作量的制约。
基于捕捉的NGS ST的进展，包括Visium HD和基于Stereo-seq的高密度流程，已将标称物理分辨率推向细胞尺度。然而在植物中，标称分辨率不应被解读为等同于有效生物学分辨率。准确的细胞级推断仍受限于不规则的细胞几何形状、分割困难、自发荧光和样品处理过程中的横向分析物扩散。这些约束在植物组织中尤为突出，因为为了克服坚固细胞壁所需的更强或更长时间的透化处理，可能以牺牲空间保真度为代价提高转录本释放。从实用角度看，区分正式平台规格与当前在植物系统中的可部署性是有益的。在当前植物研究中，基于捕捉的NGS工作流仍是全转录组空间映射最实用的选择，因为它们结合了广泛的分子覆盖与相对成熟的实验流程。相比之下，成像型高多重方法以及真正的同一切片多模态工作流在植物中仍不够标准化，通常需要大量实验定制。对于以作物为重点的研究，这一区分具有重要意义：技术上最先进的平台不一定是对给定组织类型或实验目标最稳健的选择。
尽管存在这些固有局限，基于捕捉的NGS ST仍是近期植物空间组学的主力，因为它结合了全转录组覆盖与实用可部署性。近期研究展示了其在解析发育可塑性和组织区室化中的价值：番茄愈伤组织中的Stereo-seq发现了与茎再生相关的绿色薄壁组织生态位；而棉花中空间分辨的转录组学和代谢组学分析揭示了与胚珠和纤维发育相关的局部分子程序。这些发现表明，植物ST不仅仅定位表达模式，它还揭示了组织架构如何约束生物学功能。这在热带作物中尤其重要，因为发育表现和胁迫抗性往往依赖于解剖复杂组织内的局部微环境。
解码表观遗传景观（Decoding the epigenetic landscape）
植物细胞核分离的改进使得单细胞表观基因组学分析日益可行，特别是染色质可及性测定如scATAC-seq。与捕捉基因输出的scRNA-seq不同，scATAC-seq识别开放染色质区域，映射顺式调控元件(CREs)和转录因子结合位点，从而为基因调控增添了机制性层面。里程碑式的研究已在拟南芥和水稻中生成了染色质可及性图谱，揭示了细胞类型特异性的调控特征、发育差异以及与驯化相关性状相关的可及性动态。重要的是，sc表观基因组学的价值不仅仅在于增加另一个组学层面，而在于细化对细胞身份的解读。转录组反映当前基因输出，而染色质可及性捕捉调控潜力——即细胞准备好激活或抑制的基因和调控程序。这一区分在植物中尤其重要，因为密切相关的发育状态可能仅表现出微妙的转录差异，但却具有截然不同的再生、分化或胁迫适应能力。在这种情况下，可及性图谱有助于识别允许未来转变的细胞群体，从而改进超越基于标记的状态描述的因果解释。这种调控视角在热带植物中可能特别有价值，因为热胁迫、病原体压力和反复的环境波动可能将即时的转录输出与潜在的染色质基础能力脱钩。其他单细胞表观基因组学模态开始在植物背景下被探索。TAC-seq（带有唯一分子标识符的转座酶可及染色质测序）为低输入染色质可及性分析提供了更高的灵敏度。多模态单细胞方法如SHARE-seq和SNARE-seq，能同时从同一细胞核捕获染色质可及性和基因表达，对植物而言代表了极具前景的方向，因为可以直接将调控状态与转录关联起来，无需单独实验。
然而，植物中的scATAC-seq面临多个超出scRNA-seq共享范围的技术挑战。Tn5转座酶活性可能被与细胞核共纯化的高浓度多糖和酚类化合物降低，并且每细胞相对稀疏的信号（与RNA相比）使得聚类和峰识别对细胞核质量和测序深度更为敏感。
除了scATAC分析，空间表观基因组学(spatial epigenomics)代表着一个有前景但仍主要是前瞻性的植物系统生物学方向。尽管目前主要用于哺乳动物系统，新兴技术如Spatial-CUT&Tag——结合了原位Tn5转座与微流控确定性条形码——已实现了组织切片中染色质可及性的基因组规模分析。通过将表观遗传可及性与基因表达叠加，该方法成功描绘了小鼠脑和扁桃体中组织区域特异性的调控景观。虽然在植物中尚未广泛建立，但适应性空间染色质分析将使研究人员能够超越基因表达定位，去识别原生组织架构中调控能力建立的位置。
空间蛋白质组学：从整体到微区域（Spatial proteomics: from bulk to microregions）
植物中的空间蛋白质组学当前最好从一个广泛的操作概念来理解，包括基于多重成像的蛋白质映射和基于图像引导的区域分辨微蛋白质组学。这一更宽泛的定义很有用，因为真正的高多重单细胞蛋白质成像在植物中仍技术不成熟，而LCM偶联和微区域蛋白质组学策略正变得越来越可行。传统的整体蛋白质组学量化大量植物细胞群中的平均蛋白质丰度。利用这些方法，已生成了全面的植物蛋白质组资源，包括拟南芥蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学图谱，以及覆盖14个水稻组织约15,000个蛋白质的蛋白质组图谱。整体蛋白质组学也广泛应用于研究多种植物的生理，如蒺藜苜蓿、小麦、番茄和白梨。
在这个广泛的框架内，基于多重成像的方法——包括cycIF、CODEX、IBEX、MIBI和IMC——代表了空间蛋白质组学的一个主要分支，并最近获得了广泛关注，包括被《自然方法》评为2024年度方法。然而在植物系统中，这些依赖抗体或标签的成像工作流仍然罕见，因为试剂可用性有限、专用仪器要求以及样品处理约束与动物组织差异很大。特别是，表位保存可能因优化用于RNA保留的固定或包埋方案而受损，而改善成像通道的透明化和透化策略可能改变蛋白质可及性或组织形态。来自叶绿素、酚类物质和细胞壁相关化合物的高固有自发荧光进一步复杂化了多重荧光成像，常常需要猝灭或光谱拆分策略。这些权衡使得交叉兼容的转录组-蛋白质组工作流在植物中尤为挑战。
尽管如此，空间蛋白质组学解决了转录组学的一个主要盲点：RNA丰度不能直接预测蛋白质定位、翻译后调控或酶活性。这一差距在植物中尤为重要，因为发育输出和胁迫反应常由蛋白质周转、亚细胞定位和磷酸化依赖信号控制。因此，即使是较低通量或较低分辨率的空间蛋白质组学方法也能提供仅靠转录组图谱无法提供的功能见解，目前大多数植物应用更适合描述为区域分辨或图像引导的微蛋白质组学，而非真正的高多重单细胞空间蛋白质组学。
与多重成像方法互补，空间分辨率蛋白质组学也可以通过图像引导的微蛋白质组学实现，典型示例为深度视觉蛋白质组学(DVP)（图1b）。目前，DVP尚未直接在植物系统中建立，但其逻辑——图像引导的区域选择结合超灵敏蛋白质组学——与植物微解剖分析当前需求高度吻合。DVP整合了高内涵成像和基于AI的细胞分类与激光捕获显微切割(LCM)及超灵敏质谱，实现了从组织学定义微区域的蛋白质组分析。它已应用于多种生物医学样本，包括扁桃体癌肿瘤微环境和原位移植人结肠类器官。在植物中，样品制备和质谱的最新进展显著提高了低输入材料的蛋白质组深度，缓解了基于LCM工作流的一个关键瓶颈。因此，LCM使能的空间蛋白质组学正成为连接组织微解剖与发育及环境胁迫下蛋白质组重塑的有前景策略，提供了蛋白质丰度、翻译后修饰和通路状态的区域分辨洞察。例如，将LCM与纳米液滴样品制备结合，实现了番茄果皮小微区域的蛋白质组分析，识别出约1,187–1,449个蛋白质，揭示了与能量运输和源-库关系相关的组织特异性酶和通路。在植物中，此类研究开始揭示单个器官内不同微解剖域如何分工生化劳动。在果实组织中，区域分辨的蛋白质组可以区分特化运输、储存、细胞壁重塑或代谢转化的区室，从而超越描述性解剖走向功能性组织分区。此外，一项从裸子植物到被子植物的整合性空间多组学研究结合了空间转录组学、蛋白质组学和代谢组学追踪轴向发育程序，支持了种子植物维管发育的简化进化轨迹（图1c）。这些考虑在热带植物和果实作物中可能更为重要，因为厚角质层、丰富的储存化合物、强烈的防御化学和异质的组织成熟增加了低输入蛋白提取的难度，同时也使得区域特异性蛋白质状态更具信息性。
在单细胞水平，多模态捕获技术如CITE-seq能够同时测量同一细胞的转录组和表面蛋白表位，无需单独实验即可直接关联基因表达与蛋白丰度。虽然CITE-seq主要在哺乳动物免疫细胞背景下开发和验证，但其底层逻辑——在同一微滴中对RNA和抗体衍生标签进行共条形码——原则上适用于能建立合适抗体面板的基于植物原生质体的工作流。开发植物兼容的CITE-seq或类似共捕获策略将显著缩小单细胞分辨率下RNA到蛋白质推断的差距。
映射化学货币：代谢组学（Mapping the chemical currency: metabolomics）
代谢组学提供了对植物组织化学状态的直接视图，通过分析最直接反映实现生化功能的代谢物来补充转录组学和蛋白质组学测量。在当前植物研究中，代谢组学分析日益分布在三个分析尺度——整体、单细胞和空间——每个尺度回答不同的生物学问题。碳水化合物、氨基酸、脂质、核苷酸和类黄酮等化合物不仅作为代谢底物和结构前体，还作为光合作用、呼吸、发育和胁迫适应的关键调节因子。
整体代谢组学仍然是分析整个器官或大组织区域的发现主力。根据目标分析物的理化性质，使用LC-MS/MS的靶向代谢组学能够对通路哨兵如植物激素（ABA、茉莉酸、生长素）、苯丙素、氰苷和脂质进行高置信度、超灵敏和绝对定量。作为补充，GC-MS擅长量化挥发性物质、衍生化糖类和有机酸。对于更广泛的发现，使用高分辨率LC-MS结合反相或HILIC色谱的非靶向代谢组学可在单次运行中分析数千种半极性或极性代谢物，促进功能分析和新型生物活性化合物的鉴定。
单细胞代谢组学通过捕获单个细胞的代谢指纹来应对细胞异质性。在植物中，这尤其相关，因为许多适应性和农艺性状不仅取决于哪些基因被表达，还取决于代谢物实际积累的位置。色素、防御化合物、挥发性物质、储存碳水化合物和信号分子通常高度局部化，这些空间受限的化学库比上游转录本更直接地定义组织功能。当前方法利用微提取或微流体技术，随后进行温和电离和高灵敏度质谱检测。这些策略可以揭示核心代谢物的细胞类型特异性水平，揭示保卫细胞、维管薄壁细胞和分泌结构中的差异，这些在整体分析中被平均化。然而，当前大多数应用集中在动物模型。在植物中，关键挑战包括检测低丰度代谢物所需的极端灵敏度、分离过程中的代谢周转以及细胞壁的物理屏障。未来方法开发必须优先考虑快速取样和淬灭、天然样品处理协议，以及与sc转录组身份整合的活细胞兼容工作流。
空间代谢组学保留组织架构，在植物切片内原位映射天然代谢物分布。质谱成像(MSI)是该领域的核心技术。MALDI-MSI根据基质选择，以1.2至50 μm的分辨率提供代谢物、脂质和肽的广泛覆盖。其他环境电离技术如DESI、nano-DESI和LAESI减少了样品制备要求，并提供与MALDI互补的光谱覆盖。空间代谢组学的成功取决于细致的样品制备——包括速冻冷冻切片和均质基质沉积——以及分析改进如片上衍生化和离子淌度分离以区分异构体。一个核心技术问题是切片、冷冻贴片和基质应用过程中的代谢物移位，这可能模糊真实空间模式并产生误导性分子梯度。为最小化该风险，植物组织通常需要快速冷冻、最少的解冻时间、小心控制切片厚度，以及限制分析物扩散的基质沉积方法。虽然片上衍生化可显著改善电离不良代谢物的检测，但必须谨慎应用，因为过量溶剂暴露可能扭曲天然定位。这些空间图谱已成功定位了表皮组织中的防御化合物，解析了果实和茎中的糖分和有机酸梯度，并将代谢生态位与根分泌和根际组装联系起来。
通过弥合基因表达潜力与表型现实之间的差距，空间代谢组学提供了对实现生化表型最接近的读数之一，因此对于构建植物组织的多维图谱至关重要（图1c）。它可以揭示仅靠转录组数据难以推断的代谢微环境，包括表皮层中的局部防御化学、与库活性相关的糖分梯度，以及特化组织中的分泌热点。这一能力在热带植物和代谢物丰富的作物中尤其重要，因为关键农艺和生态性状常来源于区室化的次生代谢、局部防御化学和组织特异性储存或分泌，而非统一的器官范围调控。正如后面关于切片中心工作流所讨论的，这些空间化学覆盖的收益高度依赖于以组织特异性方式控制冷冻、切片处理和基质应用。
样品制备与植物特异性屏障（Sample preparation and plant-specific barriers）
植物细胞分辨率组学通过两条实验上不同但概念上联系的上游路径推进：用于单细胞和单细胞核分析的解离中心工作流，以及用于空间测定的切片中心工作流。在这两种情况下，植物特异性组织性质在分子读取开始前深刻影响数据质量。厚细胞壁、液泡、角质层、木质化基质、富含叶绿体的细胞质和丰富的次生代谢物可能降低回收效率、扭曲代表性、损害分析物完整性并增加背景。因此，样品制备在植物中并非常规预备步骤，而是测定可行性、有效分辨率和可解释性的主要决定因素。
解离中心工作流用于单细胞/单细胞核组学（Dissociation-centered workflows for SC/SN omics）
在植物中，解离步骤通常是偏差的主要来源。最初，植物适应型scRNA-seq的进展是由基于原生质体的解离推动的。然而，原生质体的解离效率高度依赖于组织和细胞类型，因为细胞壁组成、角质层性质、木质化、液泡化和细胞几何形状存在差异。因此，某些细胞类型优先被回收而其他细胞被耗尽，产生组成偏差，使跨器官、发育阶段和物种的比较复杂化。此外，细胞壁的机械加工和酶消化可激活刺激响应通路，引入人工表达特征。这些局限加速了snRNA-seq作为互补且在某些组织中更优选的细胞分辨率转录组途径的采纳。
snRNA-seq对于全细胞酶解离效率低、扰动大或偏差大的组织尤其具有吸引力。典型的植物细胞核分离工作流集中在几个实用原则上：冰上操作以减缓降解和聚集；温和组织破碎以释放细胞核同时最小化破裂；保护性缓冲液以稳定核膜并限制RNA渗漏；以及逐步过滤以减少碎片。当需要更高纯度时，荧光染色和荧光激活细胞核分选(FANS)可以富集完整细胞核并减少细胞质污染和环境RNA。在许多植物组织中，这种细胞核优先策略相对于原生质体化提高了可行性和可重复性，并能减轻与解离相关的转录伪影的严重程度。尽管如此，snRNA-seq在植物中并未完全标准化，细胞核分离常需要在物种、器官和发育阶段间进行大量重新优化。核脆性、染色质状态和植物组织的生化背景差异很大，代谢物如多糖和酚类可促进结块或与细胞核及碎片共分离。次优条件通常表现为核聚集、破裂以及细胞器碎片和其他颗粒物质的残留，所有这些都会降低文库质量并减少有效通量。这些问题产生反复的权衡：更严格的清洗和分选可提高纯度，但增加了操作复杂性并可能降低产量；更温和的处理可保持完整性，但可能留下未解决的聚集和更高背景。
此外，必须认识到核转录组与全细胞转录组并非严格相同。虽然近期使用原生质体的高分辨率scRNA-seq研究——例如葡萄叶片在Plasmopara viticola感染期间的综合图谱——成功捕获了成熟细胞质mRNA并提供了细胞反应的全局视角，但snRNA-seq固有地分析了不同的RNA库。具体而言，snRNA-seq捕获了更高比例的非剪接内含子读数和新生转录本，而完全遗漏了定位于细胞质、叶绿体和线粒体的转录本。尽管哺乳动物研究已广泛基准化了这些差异，但sn与全细胞转录组之间的系统比较在植物中仍很稀少。未来的植物多组学整合研究在整合核和全细胞数据集时必须考虑这些生物学区室化差异，特别是当研究快速胁迫反应时，细胞质mRNA周转高度动态。这一区分对于热带胁迫生物学尤其相关，因为热、干旱和病原体反应常涉及快速转录周转和细胞类型特异性信号传导，使得scRNA-seq和snRNA-seq数据集的生物学解释不可互换。
近期方法学进展进一步说明，植物sc组学的进展往往同样依赖于上游样品制备和下游测序化学。一个显著例子是FX-Cell及其低温保存兼容衍生物，它结合了固定、优化酶消化和RNase控制，使得从难消化或低温保存的植物组织中进行scRNA-seq成为可能。通过改善细胞释放效率并将兼容性扩展到田间相关采样场景，这些工作流为常规原生质体化难以处理的组织提供了实用途径。同时，它们也突出了一个更广泛的原则，同样适用于空间组学：在植物中，稳健的分子分析通常依赖于在平台特异性读取开始前控制前分析组织处理、降解和生化干扰。
切片中心工作流用于空间组学（Sectioning-centered workflows for spatial omics）
切片中心工作流在植物空间组学中引入了一组不同的前分析约束。这些挑战不仅影响ST，也影响区域分辨的蛋白质组学和代谢组学，因为组织保存、包埋、切片、切片粘附和切片后处理都影响分子信息是否以足够的空间保真度被保留。在植物中，这些约束尤其严重，因为形态保持条件并不一定能保持分析物可及性、定位或测定兼容性。
一个主要的植物特异性屏障是细胞壁，它可能阻碍切片质量和分子可及性。在ST中，坚硬的细胞壁、角质层和木质化组织阻碍细胞边界的刻画，并限制裂解缓冲液或杂交探针的穿透（图1d）。因此，透化条件通常需要组织特异性优化，如拟南芥叶片、玉米穗轴、大豆根瘤成熟和棉花胚珠中所展示的。然而，更强或更长时间的透化可能提高分子释放，但代价是增加分析物扩散和降低空间保真度。此外，大液泡稀释了单位面积的mRNA密度，而富含叶绿体的组织产生大量质粒编码的转录本，当与核mRNA共捕获时，会稀释有效测序深度并复杂化细胞类型特异性信号解读。
对于空间代谢组学，切片引入了化学移动性的额外挑战。许多小代谢物高度可扩散，可能在冷冻、冷冻切片、解冻、基质沉积或片上衍生化过程中重新分布，从而模糊真实组织边界。植物特异性化学复杂性可进一步加剧离子抑制并降低低丰度化合物的可检测性。对于空间蛋白质组学，核心权衡通常是结构保存与分子可及性：改善切片质量的固定和包埋条件可能降低蛋白质提取性、改变表位可及性，或损害与抗体成像和低输入质谱的兼容性。
这些问题因植物组织的生化背景而进一步复杂化。次生代谢物、叶绿素和细胞壁相关化合物可产生强烈的自发荧光，干扰基于成像的平台并降低细胞分割的保真度。同时，组织处理或切片过程中的酚氧化可促进内源RNA和蛋白质的交联或降解，进一步降低信号质量。关键的是，这些物理化学屏障在热带和代谢物丰富的作物中通常尤为突出。厚的蜡质角质层、高度木质化的次生壁、丰富的多糖和富含酚类的基质可同时降低切片完整性、削弱探针穿透、增加背景荧光并复杂化分析物保留。在实践中，这意味着在顽固性组织中进行方案优化很少依赖于单一调整。相反，固定、包埋、切片厚度、透化持续时间、猝灭策略、基质应用和成像参数通常需要组合调整。因此，热带植物代表了空间组学中方案稳健性和跨物种可转移性的严格试验台。
跨植物细胞分辨率组学的共享失效模式（Shared failure modes across plant cell-resolved omics）
在解离中心工作流和切片中心工作流中，有几个反复出现的技术失效模式塑造了植物细胞分辨率组学的有效性能。首先，组织特异性物理化学性质产生强烈的代表性偏差，要么通过解离工作流中特定细胞类型的优先释放，要么通过空间测定中不均匀的切片质量和分子捕获。其次，前分析降解和分析物移位可在测序或成像开始前扭曲生物学解释。第三，生化背景——包括细胞器RNA、多糖、酚类、自发荧光和离子抑制——可大幅降低跨模态的有效灵敏度。这些共享约束有两个实际意义。第一，标称平台规格不一定反映植物组织中的有效性能，其中上游样品兼容性往往主导下游化学。第二，广泛可转移的工作流仍然有限，使得在物种、器官、发育阶段和分子模态水平上的优化难以避免。从这个意义上说，近期进展如FX-Cell不仅作为sc分析的技术解决方案很重要，也提醒我们，稳健的植物组学往往依赖于以组织感知方式解决上游样品处理问题。
分析过程中的挑战（Challenges in analytical processes）
除了湿实验考虑，植物scRNA-seq/snRNA-seq数据集提出了直接影响下游空间多组学整合的分析挑战。与此同时，该领域仍缺乏广泛采用的、针对植物定制的scRNA-seq/snRNA-seq分析流水线标准（从质控和环境RNA校正到整合和注释），这限制了跨研究可比性和参考图谱向空间数据集的转移。在植物scRNA-seq/snRNA-seq的分析挑战中，细胞类型注释仍是最关键的瓶颈，因为它直接决定所有下游分析的生物学可解释性。社区资源开始缩小这一差距；例如，PlantscRNAdb Release 4.0整合了33个植物物种的107个scRNA-seq数据集，并引入了细胞类型植物本体(POCT)，而相关的深度学习工具PCmaster_anno利用精选参考汇编改进了自动注释。一个主要挑战仍然是数据预处理和细胞注释。植物sc数据集对解离诱导伪影、细胞器转录本残留、环境RNA污染以及脆弱或富含壁细胞类型的非均匀回收特别敏感，所有这些都可能扭曲聚类和标记物检测。此外，细胞注释仍然困难，因为标记基因通常是发育阶段依赖的、物种特异性的，或在密切相关的状态间共享。因此，基于参考的注释很强大，但当标签跨器官、基因型或物种转移时应谨慎应用。更广泛地，常用框架如基于Seurat或Scanpy的工作流，以及环境RNA校正工具如SoupX，提供了有用的分析起点，但它们在植物中的输出仍强烈依赖于组织特异性预处理质量和参考数据集的生物学可比性。
对于ST，关键计算问题是物理捕获单元不一定对应生物学细胞。斑点或区域级测量通常混合来自临近细胞的转录本，使得解卷积对估计细胞组成至关重要。然而，解卷积的可靠性在很大程度上取决于scRNA-seq/snRNA-seq参考图谱的质量和实验兼容性。基因型、发育阶段、胁迫条件或样品制备的不匹配都可能降低映射准确性。为此已开发了几种代表性工具，包括用于基于参考解卷积的RCTD和Cell2location，用于将scRNA-seq/snRNA-seq定义的细胞状态映射回组织空间的Tangram和SpatialScope，以及用于细化空间域并改进有效子斑点分辨率的BayesSpace。尽管这些方法在统计公式上不同，但它们共同依赖于参考质量、空间配准以及对斑点组成的假设。在植物中，这一问题因不规则的细胞几何形状和强烈的自发荧光而进一步加剧，两者都阻碍了准确的基于图像的分割。在实践中，当前分析工作流通常结合基于参考的标签转移、解卷积、批次校正以及下游轨迹或网络推断。基于锚点的整合框架和深度生成模型可协助将scRNA-seq/snRNA-seq参考映射到空间数据集，但其输出应结合组织学、已知标记物分布和组织解剖进行交叉验证，而非不加批判地接受。在植物系统中，对这些工具进行基准测试仍然特别重要，因为不规则的细胞形状、较低的转录本密度和组织特异性制备伪影可能违反基于哺乳动物数据集建立的假设。因此，分割质量可能成为隐藏的瓶颈，限制标称的高分辨率数据能否在真正单细胞水平上被解释。
这些计算问题在多组学整合中变得更为关键，因为数据集必须在不同分子尺度、空间分辨率和时间动态之间对齐。转录组学、蛋白质组学和代谢组学信号可能来自同一组织区域，但反映不同的生物学时间尺度。因此，成功的整合需要的不仅是共定位，而是对分辨率不匹配、批次效应、配准不确定性和滞后生物学响应进行显式建模。在这些领域建立植物特异性计算基准对于该领域从描述性图谱生成走向预测性系统生物学至关重要。综合来看，这些实验和计算约束表明，植物细胞分辨率组学中的模态选择不仅应受标称平台能力指导，还应受每个分子层的分析目标和解释范围的指导。跨组学分析决策指南总结见表2。
多组学整合与“数字孪生”（Multi-omics integration and the 'digital twin'）
重要的是要认识到，这些时间不一致不仅仅是技术伪影，而是反映了信息在调控层间传递的固有生物学。转录爆发、mRNA加工、翻译调控和翻译后修饰各自引入不同的时间尺度和变异来源，这意味着单时间点上的低跨组学相关性可能代表真正的生物学解耦而非测量误差。多组学整合的目标因此不是强制一致性，而是联合建模这些分层动态并提取任何单一模态无法单独提供的机制性见解。
空间生物学的一个主要长期目标是通过整合转录组学、蛋白质组学和代谢组学图谱来构建植物组织的统一“数字孪生”。然而，这一雄心受到主要分辨率差距的制约：虽然ST可接近细胞分辨率，但MALDI-MSI通常工作在5–50 μm，而LCM蛋白质组学通常仍限于多细胞区域（>50–100 μm）。因此，将基因表达与蛋白质或代谢物丰度对齐需要解卷积、降采样或基于图的整合策略，以调和不同的空间尺度（图1d）。植物组织“数字孪生”因此应被理解为不是静态的组学层叠加，而是组织的一种预测表征，其中细胞身份、调控状态、蛋白质活性和代谢物分布在空间上配准并在时间上可解释。简单的并置是不够的，除非这些层被定量对齐、生物学上可比，并且能够支持跨模态的可证伪预测。在这个意义上，数字孪生的价值在于其生成可检验假设的能力，关于细胞命运转变、代谢生态位形成以及临近组织域间胁迫信号传播的能力。
第二个主要障碍是图像配准和测定的物理兼容性。传统上，空间组学技术被认为是破坏性的，需要使用连续相邻切片捕获不同的分子层。这一策略已在近期植物研究中成功使用；例如，Sun等结合ST与代谢组学解码棉花纤维发育，Zhan等整合scRNA-seq与MALDI-MSI映射红豆杉叶片中的紫杉烷生物合成。然而，依赖相邻切片引入了由于冷冻切片过程中组织变形导致的配准误差——这一问题在植物中因刚性细胞壁和可变膨胀压而引起的非线性扭曲而加剧。为解决此问题，近期方法学突破展示了在同一组织切片上进行多组学分析的可行性。Vicari等和Godfrey等描述的方案允许在同一切片上先进行非破坏性质谱成像再进行ST，从而实现精确的细胞到代谢物相关性。虽然目前在哺乳动物组织中开创，但将这种“同一切片”工作流适应于植物组织——可能通过克服基质兼容性和细胞壁透化问题——是该领域下一个关键步骤（图1d）。
此外，调控层之间的时间滞后复杂化了生物学解释。基因表达爆发可能不会在数小时或数天后才导致蛋白质积累或代谢输出。因此，单时间点的空间快照可能显示转录本与其相应酶或产物之间的低相关性，导致关于调控网络的假阴性结论。弥合这些差距不仅需要湿实验方案的改进，还需要开发能够从空间配准数据集中推断跨模态关系的复杂多模态深度学习框架——例如重建空间伪时间轨迹或预测代谢通量。实现这一目标将不仅需要同一切片或精确配准的多组学测量，还需要基于扰动的验证、时间采样以及将推断网络与实验观察表型联系起来的基准数据集。
在植物系统中，研究人员建议空间“数字孪生”应从操作而非理想化角度来定义。至少，它应包括：(i) 空间配准的组织学框架；(ii) 匹配的scRNA-seq/snRNA-seq参考，以提高对稀有细胞群体的敏感性、细化细胞状态注释并支持空间解卷积；(iii) 在同一切片上至少两种机制互补分子层的共检测，以转录组-代谢组共测量作为当前实用基准；(iv) 从相邻切片获得的区域匹配蛋白质组信息，例如通过基于LCM的蛋白质组学；(v) 明确的跨切片配准和不确定性控制；以及(vi) 使用独立分析对关键推断关系进行正交验证。在此定义下，数字孪生不是组学图谱的静态叠加，而是组织状态的空间锚定且实验可检验的表征（图2）。更高级的实现将进一步纳入跨发育或胁迫轨迹的时间采样，从而实现对染色质可及性、转录、蛋白质丰度和代谢物积累之间滞后关系的预测建模。
结论与展望（Conclusions and perspectives）
植物细胞分辨率生物学正从描述性图谱生成走向更机制性并最终预测性的组织功能模型。然而在植物中，进展受到一个比许多动物系统更严峻的约束塑造：这些技术的有效性能不仅取决于平台设计，还取决于植物组织能否在样品制备和分析过程中保持分析物可及性、空间保真度和分子完整性。因此，核心挑战不仅仅是提高分辨率或测定复杂度，而是构建在植物器官特征的解剖和生化条件下保持稳健的组织感知工作流。
三个优先事项可能定义该领域的下一阶段。首先，上游标准化仍然至关重要。解离偏差、切片伪影、分析物移位、细胞器干扰和自发荧光继续限制跨研究可比性和有效分辨率，尤其是在非模型和顽固性物种中。其次，转录组学与功能组学之间的当前分辨率差距必须缩小。空间蛋白质组学和代谢组学在常规细胞尺度适用性方面仍落后于转录组分析，然而它们对于理解最终决定植物表型的蛋白质活性和化学微环境不可或缺。第三，整合必须变得更加严格且更具可解释性。向植物“数字孪生”的进展不仅取决于同一切片或良好配准的多模态测量，还取决于显式建模尺度不匹配、时间滞后和跨模态不确定性的计算框架。
在此背景下，最富有成效的近期策略不太可能是为每个实验最大程度堆叠模态。更有效的路径是为特定生物学问题组合最有信息量的分子层，使用与所研究的组织、物种和分析物类别兼容的工作流。这一原则对于热带作物和富含代谢物的物种尤其重要，它们不应仅被视为下游应用目标。相反，它们代表了在真实解剖、化学和农艺约束下测试植物单细胞和空间多组学方法是否真正可转移的严格基准系统。
展望未来，植物空间多组学的长期价值将不在于生成日益复杂的图谱，而在于生成实验可检验的模型，解释调控状态、蛋白质功能和代谢输出如何在组织空间和发育时间上协调。实现这一目标将需要方法开发、基准数据集和生物学验证之间的更紧密结合。如果这些挑战能够得到解决，植物空间多组学将不仅成为描述性工具包，更成为理解发育、胁迫适应和作物表现的预测性框架。
