Meis1 异构体多样性通过在不同亚细胞区室调控 ATOH1 降解来协调神经祖细胞分化

《PLOS Biology》：Meis1 isoform diversity orchestrates neural progenitor differentiation by regulating ATOH1 degradation at distinct subcellular compartments

　　

复杂神经系统的发育受到单个基因产生的多种异构体（isoform）的严格调控，但其潜在机制尚不清楚。研究人员对小鼠小脑颗粒细胞祖细胞（Granule Cell Progenitors, GCPs）进行长读长 cDNA 测序（long-read cDNA sequencing），鉴定出超过 700 个具有高异构体多样性的基因。其中一个基因为 Meis1，其产生 MEIS1-FL（全长）和 MEIS1-HdL 异构体，分别包含和缺乏同源域（homeodomain）。研究人员先前的研究表明，MEIS1-FL 定位于细胞核，并通过转录调控促进 ATOH1 蛋白降解，从而促进 GCP 分化。相比之下，研究人员在出生后小鼠小脑中的体内电穿孔（in vivo electroporation）实验显示，MEIS1-HdL 抑制 GCP 分化。MEIS1-HdL 定位于细胞质，抑制由 CUL3（一种新鉴定的 ATOH1 E3 连接酶）介导的 ATOH1 降解。MEIS1-HdL 增强 COP9 信号复合体（COP9 signalosome, CSN）与 CUL3 的结合，从而抑制 ATOH1 的多聚泛素化（polyubiquitination）。本研究证明，源自单个基因的具有功能拮抗作用的异构体巧妙地控制了神经祖细胞的分化。

该研究背景基于复杂中枢神经系统的构建涉及众多发育步骤，其蓝图被认为很大程度上编码于基因中，但神经发育遗传机制的整体图景仍不清楚。哺乳动物仅拥有约 20,000 个基因，考虑到神经元与胶质细胞的数量类型及神经网络构建的复杂性，这一数量可能不足，因此预期单个基因通过可变剪接（alternative splicing）和可变转录起始位点产生多种异构体并发挥不同作用。每种异构体具有不同的分子结构，在不同发育阶段、细胞类型或亚细胞位置产生，实现神经发育的极复杂控制，然而数据库中注册的异构体并未涵盖所有实际异构体，目前仅识别出一小部分，常规短读长 RNA 测序（short-read RNA-seq）不足以捕获所有异构体，需长读长 RNA 测序（long-read RNA-seq），但此类分析在此背景下仍有限。神经系统发育涉及神经祖细胞增殖与分化、迁移、轴突生长、突触形成等多阶段，每阶段涉及多基因。为探讨神经祖细胞增殖与分化的机制，研究人员以小脑发育中的颗粒细胞祖细胞（GCPs）和颗粒细胞（GCs）为对象。小脑发育中，位于外外部颗粒层（outer external granular layer, oEGL）的 GCPs 初始表达转录因子 ATOH1，维持未分化与增殖状态，ATOH1 蛋白受精确降解调控，随发育进展 GCPs 丢失 ATOH1 表达并开始表达 NEUROD1，成为略微分化且增殖能力降低的 ATOH1 不表达 GCPs，随后有丝分裂后分化为 GCs。从 ATOH1 表达 GCPs 向 ATOH1 不表达 GCPs 的转变受 ATOH1 蛋白降解严格调控，但控制 ATOH1 降解的机制尚未完全阐明。本研究通过对小脑 GCPs 进行长读长 RNA 测序揭示广泛异构体多样性，鉴定出超 700 个具多异构体变体的基因，选取 Meis1 为模型基因研究其两个不同异构体，即具同源域、作为转录因子被广泛研究的全长异构体 MEIS1-FL，以及功能未知、缺乏同源域的异构体 MEIS1-HdL。MEIS1-FL 属 TALE 家族同源域转录因子，在干细胞维持、器官形成及多发育过程细胞分化中起重要作用，研究人员先前对 Meis1 功能缺失突变小鼠的基因水平分析显示 MEIS1-FL 激活 Pax6 转录、增强 BMP 信号并促进 ATOH1 降解从而增强 GCPs 向 GCs 分化，但未区分特定异构体功能。两主要 Meis1 衍生蛋白异构体在时间分布与亚细胞定位上差异显著：MEIS1-FL 在 GCPs 与 GCs 中均检测到，定位于细胞核；MEIS1-HdL 在 GCPs 中检测到而在 GCs 中无，定位于细胞质，故假设 MEIS1-HdL 在 GCP 增殖与分化中与 MEIS1-FL 功能显著不同。研究人员探讨这些 MEIS1 异构体在 GCP 增殖与分化调控中的作用，聚焦 ATOH1 降解控制，体内实验显示两异构体在 GCP 增殖与分化精确调控中发挥相反作用，各在独特细胞内位置发挥对 ATOH1 降解的相反效应，为单基因多异构体精确控制神经发生提供范例，助理解神经发生分子机制及关键蛋白降解控制机制。

作者为开展研究用到的主要关键技术方法包括：对出生后第 7 天（P7）小鼠小脑颗粒细胞祖细胞（GCPs）进行 Nanopore 长读长 cDNA 测序（long-read cDNA sequencing）并基于 Sqanti3 与 IsoQuant 进行转录本分类与定量；利用亚细胞分级分离与免疫荧光成像分析 MEIS1 异构体在 GCPs 中的定位；借助 Atoh1^AtGFP/+; Ki67^KiRFP/+双报告基因敲入小鼠通过荧光激活细胞分选（FACS）分离 ATOH1 表达 GCPs、ATOH1 不表达 GCPs 及有丝分裂后颗粒细胞（GCs）并开展 qRT-PCR；在出生后第 8 天（P8）小鼠小脑进行体内电穿孔（in vivo electroporation）过表达或 shRNA 敲低 Meis1 异构体以评估 GCP 分化与增殖；在 N2a 细胞中通过 GST pull-down、共免疫沉淀（co-immunoprecipitation）、环己酰亚胺（cycloheximide, CHX）追踪实验及体外泛素化实验探究 MEIS1 异构体对 ATOH1 泛素化与稳定性的调控；利用液相色谱串联质谱（LC–MS/MS）筛选 ATOH1 与 MEIS1 结合分子并验证 COP9 信号复合体（COP9 signalosome, CSN）与 CUL3 的相互作用。

Comprehensive long-read cDNA sequencing of cerebellar granule cell progenitors reveals extensive isoform diversity

研究人员对 GCPs 进行 Nanopore 长读长 cDNA 测序，共鉴定 99,010 条转录本，其中已知异构体占 58.3%，新型异构体占 32.6%。经 TPM>1 过滤后，11,836 个基因中 6.33% 表达 5 个及以上异构体。高异构体多样性基因（≥5 个异构体）的 GO 富集分析显示主要关联 mRNA 剪接与 RNA 加工。通过与转录因子数据库及脑发育相关基因取交集，鉴定出 Meis1、Pax6 与 Nfib 三个具高异构体多样性的转录因子，其中 Meis1 检出 7 条转录本，包含全长与缺乏同源域的主要新型异构体。

Identification of transcription factors with extensive isoform diversity in GCPs

研究人员聚焦 Meis1 深入功能分析，因其异构体多样性指向基于亚细胞定位的新调控机制：MEIS1-FL 含核定位信号（Nuclear Localization Signal, NLS），MEIS1-HdL 缺 NLS 但保留核输出信号（Nuclear Export Signal, NES）相关结构域，且 Meis1 是 Pax6 上游调节因子，故选为模型。

Meis1 gene produces two major, spatially separated protein isoforms in GCPs

Western blotting 用泛 MEIS1 抗体在 GCPs 中检出约 50 kDa 的 MEIS1-FL 与低分子量条带，后者被 MEIS1-HdL 特异抗体识别；RT-PCR 证实 GCPs 在转录水平共表达两异构体。亚细胞分级与体内电穿孔表达 MEIS1-EGFP 融合蛋白显示 MEIS1-FL 定位于核，MEIS1-HdL 定位于细胞质。

Differential expression profiles of Meis1-FL and Meis1-HdL during GCP differentiation

通过 Atoh1^AtGFP/+; Ki67^KiRFP/+小鼠 FACS 分选群体 qRT-PCR 显示，Meis1-HdL 在 ATOH1 表达 GCPs 中高度富集，在 ATOH1 不表达 GCPs 与 GCs 中极低；Meis1-FL 在各群体表达相对恒定，揭示两异构体在时空上的分区。

Opposing functions of MEIS1-FL and MEIS1-HdL in regulating GCP fate in vivo

P8 小脑体内电穿孔过表达显示，MEIS1-FL 降低 Ki67+ GCPs 比例、增加 p27+ GCs 与降低 ATOH1+ 细胞，促进分化；MEIS1-HdL 增加 Ki67+ 与 ATOH1+ 细胞、降低 p27+，维持未分化增殖状态。特异性敲低 Meis1-HdL 减少 Ki67+ 与 ATOH1+ 细胞、增加 p27+，可被敲低抵抗型 Res-Meis1-HdL 挽救；敲低两异构体（sh-Meis1-all）因效应相互抵消而未显著改变 Ki67 与 p27 比例，但 ATOH1+ 群体仍减少，提示 MEIS1-HdL 在维持祖细胞状态占主导。

MEIS1-FL and MEIS1-HdL stabilize ATOH1 protein levels

体内敲低 Meis1-HdL 降低 ATOH1 荧光强度；N2a 细胞共转染与 CHX 追踪显示 MEIS1-FL 与 MEIS1-HdL 均抑制 ATOH1 蛋白酶体依赖性降解，而缺失 MH-B 与同源域的 MEIS1（1–130 aa）无此效应，表明需完整 N 端结构域。

MEIS1 inhibits CUL3-mediated ubiquitination of ATOH1

GST pull-down 与 HA-Ub 显示 MEIS1-FL 与 MEIS1-HdL 显著降低 ATOH1 多聚泛素化。LC–MS/MS 筛选发现 ATOH1 结合分子中 E3 连接酶 Cullin-3（CUL3）及其伙伴 UBE2M、CAND1 在 MEIS1 存在时结合减弱。Co-IP 证实 MEIS1 破坏 ATOH1 与 CUL3 相互作用；敲低 Cul3 抑制 ATOH1 泛素化与降解，确立 CUL3 为 ATOH1 新 E3 连接酶，MEIS1 抑制此过程。

MEIS1 inhibits the degradation of ATOH1 induced by S328 phosphorylation

质谱与抗 p-S328 抗体显示 MEIS1 存在下 ATOH1 S328 磷酸化增强。ATOH1-S328A 稳定且 CUL3 结合弱，ATOH1-S328D 不稳定；MEIS1-FL 与 HdL 均能稳定 ATOH1-S328D，表明 MEIS1 不抑制 S328 磷酸化，而是抑制磷酸化 ATOH1 与 CUL3 相互作用。

MEIS1 inactivates CUL3 by promoting COP9 signalosome (CSN) and CUL3 complex formation

LC–MS/MS 发现 MEIS1-FL 结合 CSN 组分 COPS2、COPS3、COPS4、COPS6、COPS7a、COPS8。GST pull-down 与 Co-IP 证实 MEIS1-FL 与 HdL 均结合内源性 CSN 组分 COPS2、COPS5，并形成 MEIS1–COPS6–CUL3 三元复合体；内源 GCP 裂解液 IP 证实内源 MEIS1 与 CSN 互作。MEIS1 增强 COPS6 与 CUL3 结合，敲低 Cops6 逆转 MEIS1 抑制 ATOH1 泛素化效应。剂量反应显示 MEIS1-HdL 在低质粒量下即可稳定 ATOH1，强制核定位 NLS-MEIS1-HdL 削弱此能力，且 CUL3 主要定位于细胞质，说明 MEIS1-HdL 依赖细胞质定位发挥作用，其机制不依赖 PBX3。

The MEIS1-HdL–CSN pathway maintains GCPs in an immature state

体内敲低 Cops6 减少 Ki67+ 与 ATOH1+ GCPs、增加 p27+ GCs；共电穿孔 sh-Cops6 与 MEIS1-HdL 取消 MEIS1-HdL 维持未分化的效应，表明 CSN 是 MEIS1-HdL 在 GCP 中发挥作用所必需。

讨论部分总结：神经发育中通过可变剪接与可变转录起始位点的异构体动态转换是实现复杂细胞控制的精细策略，长读长 RNA 测序揭示异构体复杂性，但其调控神经发育的分子机制大多未知。本研究以 GCPs 与 Meis1 为模型阐明单基因多异构体精确控制神经祖细胞增殖与分化。长读长测序与免疫印迹揭示 Meis1 在 GCPs 产生 MEIS1-FL 与 MEIS1-HdL 两蛋白异构体，体内电穿孔显示二者对 GCP 增殖与分化作用相反：MEIS1-FL 抑增殖促分化，MEIS1-HdL 促增殖抑分化。MEIS1-FL 定位于核，促进 Pax6 转录与 BMP 信号依赖的 ATOH1 降解；两异构体均具抑制 CUL3 依赖的 ATOH1 泛素化与降解能力，MEIS1-HdL 在剂量响应上表现更强，主要归因于其细胞质定位更利于接触细胞质 CUL3–ATOH1 机制，且强制核定位削弱其稳定 ATOH1 能力。MEIS1-HdL 主要在未分化 GCPs 表达，随发育丢失促分化。研究鉴定 CUL3 为 ATOH1 新 E3 连接酶，发现 MEIS1 通过增强 CSN 与 CUL3 结合抑制 CUL3 活性，且 MEIS1 还能稳定其他 CUL3 靶蛋白如 NRF2、PP2A/C，可能广泛参与蛋白降解控制。该发现具超越小脑发育的意义：MEIS1、CUL3 与 CSN 失调见于多种肿瘤，MEIS1 除转录调控外可能通过非转录调控蛋白降解参与肿瘤发生。单基因产生功能迥异异构体是进化保守策略，果蝇 homothorax（hth）及 MEIS 家族其他蛋白亦具类似机制，本研究发现的 MEIS1-HdL 支持此保守逻辑：可变剪接将蛋白互作域与 DNA 结合域解偶联以多样化基因功能。未来结合长读长与单细胞分析将更高分辨率揭示脑中转录异构体表达时空图谱。

研究结论部分翻译：MEIS1-FL 与 MEIS1-HdL 对 ATOH1 降解与 GCP 分化具相反效应，其时间分布亦不同。小脑发育中 MEIS1-FL 从 GCPs 至 GCs 持续产生，而 MEIS1-HdL 转录本富集于未成熟 GCPs 且在 GCs 中基本缺失。在两异构体均检出的未成熟 GCPs 中，MEIS1-HdL 作用占主导，导致 ATOH1 蛋白稳定；随发育进展，因 MEIS1-HdL 表达丢失，MEIS1-FL 占主导，致 ATOH1 降解并推进向 GCs 分化。因此，这两 MEIS1 异构体是单基因拮抗异构体严格调控神经发生的良好范例。研究人员鉴定 CUL3 为 ATOH1 的新型 E3 连接酶，并发现 MEIS1 抑制其功能。已知 CUL3 活性受 COP9 信号复合体（CSN）抑制，本研究提示 MEIS1（尤细胞质定位 MEIS1-HdL）具类似功能，增强 CUL3 与 CSN 结合从而抑制 CUL3 活性，最终精细调控 ATOH1 降解。此外研究人员显示 MEIS1 能稳定除 ATOH1 外的 CUL3 靶蛋白如 NRF2 与 PP2A/C，且蛋白质组分析提示 MEIS1 还结合 CUL1 与 CUL4 等其他 CULLIN 家族蛋白，表明 MEIS1 可能广泛参与蛋白降解调控。这些发现在小脑发育背景外具广泛生物学意义：MEIS1 与 Cullin-RING E3 泛素连接酶机制（含 CUL3 与 CSN）失调常见于多种肿瘤，MEIS1 与 COPS5 在某些急性髓系白血病中过表达，COPS5 转基因小鼠造血干细扩增呈骨髓增生异常表型，Meis1 过表达促进造血干祖细胞异常自我更新与分化阻滞。迄今认为 MEIS1 通过其转录调控功能致白血病与肿瘤，但本研究提示 MEIS1 也可能通过非转录调控功能控制相关蛋白降解而促肿瘤发生。单基因产生功能迥异异构体是基本且进化保守策略，尤其见于转录因子；例如果蝇 Meis 同源基因 homothorax（hth）产生无同源域异构体，具区别于全长蛋白的关键功能；MEIS 家族其他蛋白如 MEIS2 蛋白酶解生成无同源域产物，特定 MEIS2 剪接变体参与神经母细胞瘤；MEIS1 下游 Pax6 可变剪接产生改变 DNA 结合特性的异构体对正常神经发育至关重要。本研究在哺乳类小脑发育中发现功能性 MEIS1-HdL 异构体与此机制平行，提示一种保守调控逻辑：可变剪接动态将蛋白互作域与 DNA 结合域解偶联以多样化单基因功能。未来结合长读长测序与单细胞分析技术的研究将揭示更高分辨率脑蓝图，展示各转录异构体在何时于何种单细胞中表达。论文发表在《PLOS Biology》。