法医转录组与微生物组的协同整合：一种结合多标记策略与机器学习的精准体液识别方法

《Forensic Science International: Genetics》：Synergistic integration of forensic transcriptome and microbiome: a robust multi-marker strategy combined with machine learning for accurate body fluid identification

　　

王希|梁秦岭|袁曦|蔡美明|朱博峰

中国广州南方医科大学法医学学院，精准鉴定法医多组学关键实验室

摘要

近年来，微生物组与转录组分析技术的发展显著提升了法医液体鉴定的效率。然而，在实际法医工作中，由于生物证据有限或存在疑问，需要高效利用遗传物质以减少样本损失。本研究基于毛细管电泳技术开发了两种独立的检测方法：21种mRNA检测法和10种细菌检测系统。通过分别提取RNA和DNA，利用mRNA分析技术识别五种体液，同时借助细菌标记物特异性识别唾液和阴道分泌物。针对这两种检测系统，我们进行了特异性、敏感性以及混合样本和老化/降解样本的验证实验。为实现准确且智能的体液及组织类型鉴定，本研究构建并评估了四种机器学习模型（随机森林、K最近邻、支持向量机以及朴素贝叶斯）。

验证实验表明，这两种系统都具有较高的特异性，但在非目标样本中存在轻微的交叉反应。这两种独立检测方法即便在1纳克RNA或0.1纳克DNA的低浓度下，或是从1微升甚至1/16份拭子中提取的微量样本中，仍能获得稳定的检测结果。此外，21种mRNA检测法和10种细菌检测系统还能有效分析大多数老化或降解的样本及混合样本。尽管在某些复杂样本（如1微升的精液或老化/降解的精液）中检测效果不佳，但支持向量机分类器的性能仍优于其他机器学习模型，在独立测试集中，无论是单一来源的体液还是混合样本，其分类准确率均为100%。总体而言，本研究将多组学生物标志物与先进的机器学习模型相结合，为精准鉴定体液提供了强有力的技术支持，有助于实际法医应用。

引言

准确鉴定犯罪现场发现的生物证据的来源组织类型，是法医案件调查和司法程序中的关键步骤，它有助于还原犯罪过程，并建立嫌疑人与特定犯罪行为之间的关联。传统方法存在固有局限性：初步检测有时缺乏特异性，可能导致误报；而确证性检测往往具有破坏性，且需要消耗大量样本[1]、[2]。因此，分子生物标志物（信使RNA、微RNA、环状RNA、piwi相互作用RNA以及DNA甲基化）和微生物组分析作为一种替代方法，被用于识别体液的来源组织，以应对这些法医挑战[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。

此外，处理低含量模板生物证据时，需要采用能够在不消耗有限样本的前提下最大限度恢复数据的策略。为此，经过验证的DNA/RNA共同提取技术使得法医实验室能够对同一样本同时进行DNA分析（用于鉴定）和基于RNA的体液鉴定[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。一些欧洲法医机构最近的全面评估也证实了这类共同提取技术的有效性，表明在复杂的法医样本中，仍可成功实现DNA和RNA的高效提取及后续分析[12]、[13]。

在这些分子生物标志物中，mRNA检测是目前最为成熟且广泛应用的体液鉴定技术，已通过多项联合研究得到验证[9]、[11]、[13]、[14]。不过，mRNA标记物的片段长度相对较长，容易在环境因素（如湿度及紫外线辐射）作用下发生降解。虽然微RNA等短片段RNA的稳定性更高，但关于不同组织中微RNA表达差异的研究结果并不一致[15]、[16]。与此同时，用于体液鉴定的、经过普遍验证的新型RNA生物标志物（如环状RNA和piRNA）的相关检测体系仍有待进一步深入开发[8]、[17]、[18]。为克服仅使用某种RNA类型生物标志物进行体液鉴定的局限性，研究人员开始探索mRNA与微RNA共同检测的方法。例如，陈等人研究表明，利用qPCR技术同时检测mRNA和微RNA，对于降解的体液样本具有显著优势[19]。不过，Bamberg等人指出，由于缺乏专门针对唾液的微RNA和piRNA生物标志物，检测降解唾液样本的效率较为有限。由于阴道分泌物和唾液都富含鳞状上皮细胞，它们共享一些人类上皮生物标志物，这容易导致交叉反应，从而在降解样本或混合样本中难以准确区分这两种体液[20]。

为解决人类RNA标记物的局限性及交叉反应问题，法医研究人员越来越多地利用人体微生物组作为辅助工具来鉴定体液[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。人体内存在着多种多样的微生物群落，据估计，微生物细胞总数与人类细胞的比值约为1:1[27]。对于法医应用而言，这些分布广泛的微生物具有显著优势：它们的细胞壁结构更为坚固，相比人类细胞和RNA标记物具有更高的稳定性[28]、[29]。随着下一代测序技术的进步，许多研究已经建立了标准的微生物组分析流程，用于体液鉴定，并成功将其应用于复杂的犯罪现场污渍及模拟的法医混合样本中[30]、[31]、[32]、[33]。口腔和阴道内存在着不同的细菌菌群，这些菌群可作为高度特异性的微生物生物标志物，帮助区分阴道分泌物和唾液与其他体液。这类微生物特征不仅能有效解决上皮细胞带来的交叉反应问题，还能在复杂的生物混合样本中保持较高的检测稳定性，而传统mRNA标记物在这种环境下通常无法给出满意的结果[34]、[35]、[36]、[37]。

除了选择稳定的生物标志物外，运用机器学习模型还可以帮助准确解读复杂的分子特征[38]、[39]。例如，田等人将ARMS-PCR技术与随机森林分类器结合，用于分析DNA甲基化模式，实现了超过99%的单一来源体液鉴定准确率[39]。为进一步解决混合样本的鉴定难题，Ypma等人通过模拟混合mRNA数据，训练出了多标签逻辑回归模型，成功建立了定量似然比框架，可用于概率性鉴定混合样本中的目标体液[38]。

为充分发挥mRNA的广泛鉴定能力与细菌DNA的高稳定性优势，我们基于毛细管电泳技术开发了两种独立的检测方法——21种mRNA检测系统和10种细菌检测系统。对于同一样本，我们首先共同提取RNA和DNA，再分别进行扩增。具体而言，21种mRNA检测系统包含21种mRNA标记物以及三种内参基因，可用于识别五种常见的法医体液；而10种细菌检测系统则是专门设计用于准确识别阴道分泌物和唾液样本。本研究全面评估了这两种检测方法在特异性、敏感性以及面对降解和老化样本及七种不同类型混合样本时的表现。此外，我们还运用机器学习分类模型，分析了这两种检测方法在鉴定单一来源体液及七种类型混合样本时的预测能力。

章节节选

21种mRNA检测系统和10种细菌检测系统的标记物选择与多重检测设计

体液特异性mRNA标记物的选择依据的是以往的研究成果。作为细胞色素P450家族的成员，CYP2B6被选为识别阴道分泌物的特异性mRNA标记物[40]、[41]。其他用于识别阴道分泌物的mRNA标记物还包括在细胞分裂过程中起关键作用的FAM83D[42]，在阴道上皮细胞中高表达的MUC4，以及SFTA2和SERPINB13[43]、[44]。在唾液鉴定方面，除了常用的mRNA标记物HTN3和STATH之外，我们还纳入了其他标记物

初步验证实验

图2显示了16份唾液样本和16份阴道分泌物样本（每类样本来自8名不同捐赠者）中BDNA和TDNA这两种细菌标记物的浓度及检测情况。在大多数阴道分泌物和唾液样本中，同一名个体提供的样本中TDNA的浓度低于BDNA，但两种类型的DNA中可检测到的细菌标记物种类一致，且RFU值都很高（RFU大于5000）。虽然阴道分泌物样本中可检测到的细菌标记物种类相对较少，

讨论

近期的法医研究越来越重视通过mRNA分析及微生物群落分析来实现体液鉴定[15]、[21]、[58]。本研究构建了一种基于毛细管电泳技术的联合分析流程，该流程采用了高效的核酸共同提取技术，并结合了两种独立的检测系统。该平台一方面利用21种mRNA检测系统识别五种常见体液，另一方面通过10种细菌检测系统提升唾液和阴道分泌物的鉴定准确性。此外，我们还对这种鉴定系统的分类性能进行了评估

结论

本研究通过毛细管电泳技术开发了21种mRNA检测系统和10种细菌检测系统，并结合四种机器学习模型，实现了精准的体液鉴定。转录组与微生物组标记物的结合使用提升了鉴定的特异性和敏感性。在这些模型的支持下，该系统在各种实验条件及混合样本中的鉴定准确率均很高（分别为100%和≥96%），其中支持向量机模型的表现最佳。对于大部分体积较小的样本（1-25微升），尽管传统的共同提取方法会

资金支持声明

本研究得到了国家自然科学基金的支持（项目编号：82293652）。

作者贡献

所有作者都参与了这项研究。本研究的实验构思和研究方法均由BZ设计，同时他还负责实验设计的验证、整体监督以及初稿的审阅和修改。XW负责数据的收集、分析、解读、初稿撰写以及实验结果的可视化处理。YL、XY、QL和MC则参与了初稿的修改工作。

CRediT作者贡献说明

蔡美明：写作——审阅与编辑。袁曦：写作——审阅与编辑，概念构思。梁秦岭：写作——审阅与编辑。王希：写作——审阅与编辑，原始草稿撰写，结果可视化，验证，数据整理，概念构思。朱博峰：写作——审阅与编辑，资金筹集，数据整理。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

无

参与同意书

本研究已获得所有参与者的知情同意。

发表同意书

不适用。