利用数字生物混合技术控制明胶-羧甲基纤维素-壳聚糖自交联水凝胶的均匀三维网络，实现多层挤出式3D生物打印

《International Journal of Biological Macromolecules》：Controlling homogeneous 3D network of gelatin-carboxymethyl cellulose-chitosan self-crosslinked hydrogel with digital biomixing for multilayered extrusion 3D bioprinting

　　Saleha Akter|Amitava Bhattacharyya|Sunggeun Lee|Oscar Manuel Benavides Bastidas|Insup Noh•物理交联的明胶-羧甲基纤维素-壳聚糖水凝胶•利用Biowork Pen?实现结构平衡，提升稳定性•氧化羧甲基纤维素的运用可改善3D生物打印性能•具有高形状保真度的自支撑复杂3D生物打印结构•优异的细胞相容性及对细胞的支撑能力，可用于体外伤口愈合

引言
三维（3D）生物打印作为一种先进的快速发展的增材制造技术，在组织工程和再生医学领域得到了广泛应用，它能够将活细胞与生物材料支架结合在一起，用于制造个性化的工程化组织[1][2]。基于挤出的3D生物打印技术被广泛使用，尤其擅长通过计算机辅助设计精确地逐层沉积多种生物墨水，从而构建出复杂的3D生物打印结构。这类结构既能提供生化信号，又能传递生物物理信号，有助于修复受损的组织和器官，同时还能精准模拟天然的细胞外基质[3]。对于基于挤出的3D生物打印而言，需要一种具有高挤出性、自愈合能力、自支撑性的预交联水凝胶生物墨水。然而，要设计出一种既能满足所有所需物理化学性质，又能确保3D打印结构的机械强度，从而为包裹其中的细胞创造理想微环境的生物墨水，仍是3D生物打印领域面临的关键挑战[4]。

水凝胶在组织工程中的应用时，其打印后的稳定性是一个重要因素。通过物理或化学交联机制形成的水凝胶均可用于3D生物打印。近年来，由于在温和条件下即可实现简单的凝胶化过程、具有良好的生物相容性，且无需使用有毒的化学交联剂，人们对开发物理交联水凝胶的兴趣日益浓厚。不过，这类水凝胶的机械性能和流变性能较差，易膨胀，降解速度也较快[5][6]。尽管已经有了许多改进措施，但由于化学交联能形成更强的共价键，且打印后的结构保持性更好，因此它仍然是打造高性能、结构均衡的水凝胶的主要技术手段[7]。通过化学共价键原位自交联形成的水凝胶是一种获得高度稳定、生物相容且结构均衡的水凝胶方法的理想选择。人们采用了多种策略来改进物理交联水凝胶，增强构成聚合物链之间的物理相互作用，从而赋予其诸如坚固性、与组织的黏附性、延展性、自愈合能力以及形状记忆等功能，使其在组织工程和3D生物打印应用中表现出色[6][7]。然而，要将纤维素、明胶和壳聚糖等多种高粘度生物聚合物整合到生物墨水中，并仅依靠物理交联就能保持其在生物力学性能上的均匀性，对传统的混合工艺来说是一项艰巨的任务。而先进的Biowork Pen?则可以解决这一问题，它已被证明能够更好地实现多组分生物墨水的结构平衡与均匀混合，这些生物墨水包含不同的生物聚合物、生物活性分子以及活细胞，进而有助于实现更理想的组织再生[8][9][10]。

由于各种聚合物水凝胶不仅各自具有优良的生物力学性能，往往还具备协同效应，而且打印后的结构稳定性也好，因此它们已成为组织工程和3D打印领域极具前景的生物材料。研究表明，纤维素能够提升纤维素-壳聚糖以及纤维素-明胶水凝胶的机械性能和打印性能[11]。因此，通过天然衍生的明胶、羧甲基纤维素和壳聚糖等聚合物的自交联作用，形成一种生物源性的复合网络水凝胶矩阵，有望成为组织工程应用的理想材料。多位研究人员指出，明胶、壳聚糖和羧甲基纤维素可制成用于皮肤、韧带、骨骼、软骨以及其他组织工程应用的有效生物源性水凝胶材料[11][12]。明胶是通过胶原蛋白的不可逆水解和变性得到的，它在组织工程中被广泛用作水凝胶生物材料。作为一种天然蛋白质，明胶具有出色的生物相容性、可生物降解性以及无免疫原性。由于其结构中存在如Arg-Gly-Asp（RGD）这样的酸性氨基酸序列，明胶具有很强的细胞黏附识别功能[13][14]。不过，使用纯明胶水凝胶作为生物墨水来复制天然组织的复杂结构及其细胞特性仍面临诸多难题，比如其机械性能较差，且由于降解速度过快，短期稳定性也不佳[15][16]。为了解决这些问题，研究人员引入了羧甲基纤维素[11]和壳聚糖[12]等生物聚合物，以增强明胶水凝胶的结构性能。在生物墨水配方中结合蛋白质和多糖，对3D生物打印而言具有显著优势。这种组合能够提升各组分的生物物理性能，进而提高其机械强度、3D打印性能、粘弹性、细胞相容性以及细胞增殖能力[17][18]。

在生物打印领域，羧甲基纤维素是一种阴离子聚电解质多糖，它具备3D生物打印用水凝胶墨水的一些关键特性，比如高亲水性、柔韧性、粘度可调性、粘弹性、剪切诱导的排列能力以及形状恢复能力。通过对它进行物理或化学改性，就可以制成生物墨水，这些改性带来的好处包括良好的生物相容性、较慢的生物降解速度、细胞相容性、一定的机械强度、良好的黏附性，以及适宜的表面特性，这些特性有利于蛋白质的吸附、细胞的聚集和增殖，从而为3D生物打印和组织工程应用提供支持[19][20]。不过，仅使用羧甲基纤维素来制备水凝胶仍存在一些问题，因为这类水凝胶含有大量水分，容易引发微生物降解，从而限制了其储存时间。通过加入具有抗菌功能的另一种材料，可以有效抑制这种由微生物引起的质量下降现象[20]。明胶也存在类似的问题，这也限制了它的长期储存和使用[15]。壳聚糖是由β-(1,4)-连接的2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖单元构成的，它是一种带正电荷的天然多糖，可通过对几丁质的碱性脱乙酰化得到。壳聚糖对细菌和真菌具有出色的抗菌和抗真菌活性[20][21][22]。它是一种无毒、生物相容、可生物降解、具有止血作用且能黏附黏膜的聚合物，被广泛用于制备可注射的水凝胶和可用于3D生物打印的水凝胶[22][23]。其聚合物链上含有大量的活性-NH2和-OH基团，这使得它能够与明胶和羧甲基纤维素结合，形成稳定的水凝胶网络。

将纤维素与壳聚糖、明胶等生物打印用聚合物相结合，可以提升其在组织工程和3D生物打印领域的多功能性能。补充表1总结了明胶、羧甲基纤维素、氧化羧甲基纤维素和壳聚糖在提升复合水凝胶的机械性能、打印性能以及生物性能方面的作用。有人曾使用壳聚糖/明胶混合物来制备用于伤口愈合和3D打印的合适生物墨水，但所打印出的支架稳定性较低[24]。为提高其稳定性，有人通过在明胶上接枝羧甲基壳聚糖，然后利用氧化细菌纤维素与带有氨基的明胶发生交联，从而合成了一种具有自愈合功能的3D生物打印用水凝胶[25]。这种水凝胶的机械性能和细胞相容性都有所提升。尽管这一过程需要经过多个交联步骤，耗时较长，但相关研究已表明，明胶、纤维素和壳聚糖的组合具有较好的3D打印性能，有望用作生物墨水。

在本研究中，研究人员优化了一种先进的三元聚合物复合水凝胶墨水，通过平衡明胶、羧甲基纤维素和壳聚糖之间的复合网络，从而制成了适合用于组织再生的、具有良好打印后生物力学性能的挤出式3D生物打印墨水（见图1）。在构成这种结构均衡的水凝胶生物墨水的三种成分中，明胶的细胞支撑能力更强，因为它属于胶原蛋白的水解产物，而胶原蛋白是细胞外基质的一种成分。但仅用明胶制成的水凝胶结构不够稳固，不适合用于打印复杂结构的3D物体。因此，本研究旨在提高最终水凝胶中的明胶含量。这种三元聚合物水凝胶的交联机制涉及多种关键的相互作用，包括三种聚合物之间通过羧甲基纤维素的-COOH基团与明胶和壳聚糖丰富的-NH2基团之间形成的聚电解质复合物、明胶与壳聚糖之间形成的聚电解质复合物，以及三种聚合物链上的-OH基团之间形成的氢键。要实现仅依靠物理键合就能形成如此结构均衡的水凝胶，就必须合理选择这些聚合物的比例，并在混合过程中确保其均匀分布。在这方面，我们团队开发的先进Biowork Pen?相比传统的混合工艺更具优势，它能够使生物墨水各组分更加均匀地混合[9]。虽然这种水凝胶在多层3D打印和注射应用方面展现出巨大潜力，但由于其亲水聚合物网络中吸水率较高，其在机械性能和稳定性方面可能存在一定缺陷。预计将化学交联和物理交联策略结合到复合网络中，能够进一步提升水凝胶的物理性能、机械性能以及打印后的性能。因此，人们在羧甲基纤维素的聚合物链上引入了醛基。氧化羧甲基纤维素中的醛基可以与明胶和壳聚糖中大量的氨基发生席夫碱反应，形成动态的亚胺键（见图1）。这样，氧化羧甲基纤维素就可以通过化学交联与蛋白质（明胶）和多糖（壳聚糖）结合，再结合物理交联策略，共同构建出结构均衡的水凝胶网络。人们推测，这种复合网络水凝胶可以通过物理和化学机制实现交联位点的均匀分布，从而具备可调控的物理和机械性能，进而改善其膨胀率、降解速率、挤出性能以及3D打印时的形状保持能力，而且无需对打印出的3D结构进行后续交联处理。Biowork Pen?不仅可用于分布交联位点以形成凝胶，还可用于制备含有小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）的多层复杂3D生物打印结构，从而实现皮肤组织再生和伤口愈合。利用Biowork Pen?对预交联的可挤出水凝胶和活细胞进行均匀的剪切混合，是一种让细胞在水凝胶网络中均匀分布的优质方法，有助于实现可控的复杂组织再生。Biowork Pen?的差动双螺杆挤出机制使得我们能够通过选择合适的螺杆转速来确保细胞具有最高的存活率，进而通过可控的剪切混合，在更短的时间内实现细胞均匀分布的生物墨水的连续3D打印，同时还能保持较高的细胞存活率[26][27]。据我们所知，我们此次提出的一种新型水凝胶矩阵在组织工程应用方面具有出色的3D打印性能。

材料
明胶（G）来自牛皮（B型，凝胶强度约为2.207帕，CAS编号为9000 - 70 - 8，25℃时1.5%溶液的pH值在5.0 - 7.5之间，平均分子量为40 - 50千克/摩尔）；羧甲基纤维素（C）钠盐（中等粘度，25℃时2%水溶液的粘度为400 - 800厘泊）；壳聚糖（Ch；高分子量，为310000 - 375000道尔顿，脱乙酰化程度超过75%）；乙二醇（分子量：62.07）；过碘酸钠（NaIO4，ACS级试剂，纯度≥99.8%），以上材料均购自美国Sigma Aldrich公司。小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3购自该公司。

水凝胶的表面形态与化学分析
图2（a - f）显示，通过扫描电子显微镜对两种经冷冻干燥后的3D打印水凝胶样本的表面形态进行了分析。G - C水凝胶的三个样本都具有3D多孔微观结构，但较大且不规则的孔隙数量较少，这可能是由于水凝胶内的交联密度较低，导致聚合物网络较为松散。随着明胶含量的增加，孔隙数量减少，水凝胶结构变得更加致密。从物理层面来看……

结论
要制备适用于挤出式3D生物打印的、经过物理和化学交联的三元聚合物生物水凝胶，且不使用任何化学或物理交联添加剂，是一项颇具挑战性的任务。在本研究中，人们选择了明胶、羧甲基纤维素和壳聚糖这三种重要的生物聚合物用于生物打印。就物理交联而言，B型明胶和羧甲基纤维素都属于阴离子物质，它们能与阳离子物质形成聚电解质复合物……

作者贡献说明
Saleha Akter：撰写——初稿、方法学、实验研究、正式分析、概念构思。Amitava Bhattacharyya：撰写——审阅与编辑、正式分析。Sunggeun Lee：提供资源。Oscar Manuel Benavides Bastidas：提供软件、资源。Insup Noh：撰写——审阅与编辑、验证、监督、提供资源、项目管理、资金筹集。

利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文所述研究的已知财务利益或个人关系。

致谢
作者感谢韩国国家研究基金会、韩国研发成果商业化促进机构COMPA、韩国中小企业技术信息促进机构提供的支持（项目编号分别为RS - 2024 - 00407534、RS - 2022R1A2C2006341、RS - 2024 - 00423953、RS - 2024 - 00510588）。