α-突触核蛋白修饰的纳米共轭物靶向α-突触核蛋白组装

《International Journal of Biological Macromolecules》：Alpha-synuclein-decorated nanoconjugates targeting alpha-synuclein assembly

　　

α-突触核蛋白(alpha-synuclein, αS)是一种参与突触调节的神经元蛋白，其病理性聚集是包括帕金森病在内的突触核蛋白病的标志。尽管αS具有生理重要性，但其固有无序性质和构象可塑性使机制理解与治疗靶向均具挑战。研究人员探讨了蛋白功能化纳米颗粒(nanoparticles, NPs)作为调控和探测αS组装途径（包括聚集与液液相分离(liquid–liquid phase separation, LLPS)）的工具。研究人员通过在聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)包覆的二氧化硅NPs上共价连接位于αS三个功能区域（第18、76和140位）的单半胱氨酸αS变体，设计了三种纳米共轭物。这些共轭物保留了αS的无序特征，表现出低细胞毒性，并被神经元细胞内化。功能实验揭示了位点依赖性效应对聚集的影响：NP-αSA76C显著延迟αS纤维形成并进一步抑制淀粉样tau蛋白聚集，提示其干扰成核机制；而NP-αSA18C适度加速聚集并对成熟纤维表现出强亲和力。所有纳米共轭物均分配至αS凝聚体中（虽无显著位点差异）并与模型脂质膜相互作用。综上，αS功能化NPs影响蛋白聚集与凝聚体相互作用，具有情境依赖的位点特异性。这些发现凸显了共轭位置在调控NP–蛋白相互作用中的重要性，并强调这些纳米共轭物在探索和调控神经退行性疾病中病理性蛋白组装的潜力。

该研究发表于《International Journal of Biological Macromolecules》。研究背景方面，α-突触核蛋白(alpha-synuclein, αS)是神经元中富含的突触相关蛋白，其病理性聚集是突触核蛋白病如帕金森病的核心特征。αS为140个氨基酸的固有无序蛋白，包含两亲性N端域(1–60)、疏水中部NAC域(61–95)及酸性C端域(96–140)，具有高度构象可塑性。αS聚集通过成核-生长途径进行，早期寡聚体具有细胞毒性，且αS可发生液液相分离(liquid–liquid phase separation, LLPS)形成生物分子凝聚体，进而向淀粉样纤维转变。由于αS缺乏稳定结构及明确小分子结合口袋，针对其聚集的治疗与诊断策略面临挑战。纳米颗粒(nanoparticles, NPs)可作为人工受体或分子伴侣调控蛋白聚集，但共轭位点对相互作用的影响尚不清楚。因此，研究人员通过开展αS不同位点功能化NPs的构建与表征，探究其对αS组装、凝聚体及跨蛋白相互作用的调控规律，为突触核蛋白病机制研究与干预提供工具。

为开展研究，研究人员主要采用以下关键技术方法：合成具有二氧化硅核心与PEG壳层并带有马来酰亚胺基团与罗丹明荧光基团的NPs；通过PCR位点定向诱变获得αS^A18C、αS^A75C、αS^A140C单半胱氨酸变体并在大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)中重组表达纯化；通过硫醇-马来酰亚胺偶联制备NP-αS纳米共轭物；利用动态光散射与ζ电位、液体核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)与异核单量子相干(¹H,¹⁵N-HSQC)表征共轭物尺寸、表面电荷与构象；通过硫黄素T(thioflavin-T, ThT)荧光动力学、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)、透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)与衰减全反射傅里叶变换红外光谱(attenuated total reflection Fourier-transform infrared spectroscopy, ATR-FTIR)分析αS聚集行为与纤维形态；利用荧光显微镜与分区系数定量评估共轭物在αS及αS/tau凝聚体中的分配；通过沉降实验评估共轭物与预成型纤维的结合；利用固体态²H与³¹P NMR研究共轭物与多层囊泡(multilamellar vesicles, MLVs)模型的膜相互作用；采用SHSY-5Y人神经母细胞瘤细胞进行激光共聚焦显微镜观察与MTT细胞活力实验评估生物相容性与细胞内化。

研究结果如下：

2.1. Description of nanoparticles and α-synuclein derivatives

研究人员合成了平均流体力学直径约24 nm的二氧化硅–PEG核心–壳NPs，并通过紫外–可见吸收光谱估算每个NP共轭约3–4个蛋白分子，共轭后粒径增至31–41 nm，ζ电位变为?14至?21 mV，琼脂糖凝胶电泳显示向正极迁移增强。

2.2. Α-Synuclein conjugated to NPs retains conformational dynamics

通过¹H NMR观察到共轭物呈现尖锐蛋白信号，¹H,¹⁵N-HSQC谱显示信号与游离蛋白大体重叠且局限于窄谱窗，表明共轭后αS仍保留无序构象与显著运动性，未形成稳定结构。

2.3. Α-Synuclein aggregation kinetics vary with nanoconjugate type

ThT动力学显示未共轭NPs使αS聚集滞后相几乎加倍；NP-αS^A76C强烈抑制聚集，观测期内未达平台；NP-αS^A140C呈中等抑制；NP-αS^A18C则加速成核使聚集加快。SDS-PAGE证实NP-αS^A18C存在下单体几乎耗尽，而NP-αS^A76C中仍存大量单体。

2.4. NP-αS conjugates do not affect αS aggregate morphology but differentially associate with aggregates

TEM显示各条件下形成的聚集体均为纤维状碎片，形态无明显差异；ATR-FTIR显示酰胺I区均以1623 cm^?1平行β折叠为特征，次要峰位略有变异。沉降实验荧光分析表明所有功能化共轭物较未共轭NPs更易结合预成型αS纤维，其中NP-αS^A18C上清荧光最低，对成熟纤维亲和力最强。

2.5. NP-αS conjugates are recruited into αS liquid condensates

在10% PEG-8000诱导下，未共轭NPs极少进入αS凝聚体；而三种αS功能化NPs均高效分配入凝聚体，分区系数P显著升高，皮尔逊相关系数显示与FITC标记αS共定位良好。NP-αS^A18C的P值略高，但整体分配对共轭位点不敏感。

2.6. Interaction of NP-αS with assemblies of tau protein

TEM显示tau^297–391在NP-αS^A76C存在下形成无定形聚集体而非纤维，提示其延缓tau纤维化；NP-αS^A18C则与tau纤维紧密结合并在TEM中可见颗粒附着，沉降实验显示其对预成型tau纤维亲和力最高。在全长tau与αS异型凝聚体中，未共轭NPs偏于边缘，而共轭物均匀分布于内部，分区系数提升。

2.7. Interaction of NP-αS with lipid membranes

固体态²H NMR显示未共轭NPs不改变POPC或POPS多层囊泡酰基链四极裂分；共轭物则引起信号强度下降但不改变裂分模式，表明其在膜表面结合引起横向弛豫时间T₂缩短而未破坏疏水核心完整性。³¹P NMR同样显示强度下降证实表面结合。在POPS囊泡中，NP-αS^A76C与NP-αS^A140C引起更强信号下降与包络变窄（酰基链流动性增加），而NP-αS^A18C效应较弱，可能与位点18位于膜结合两亲螺旋面导致空间位阻及电荷分布改变有关。

2.8. Biocompatibility of nanoconjugates

共聚焦显微镜显示所有NPs在SHSY-5Y细胞中以红色颗粒形式存在于胞质近核区，极少入核，内化水平相似。MTT实验表明处理24小时后细胞活力较对照降低约15–20%，游离αS无毒性，毒性源于NP核心而非共轭蛋白，与膜非破坏性结论一致。

总结讨论部分，研究人员指出：该项工作评价了αS修饰NPs靶向αS聚集与液液相分离凝聚体的能力。通过在PEG包覆二氧化硅NPs表面共价连接跨越αS三域的第18、76、140位单半胱氨酸变体，获得三种纳米共轭物，其保留无序构象、低细胞毒性并可被神经元细胞内化。NP-αS^A76C显著延迟αS及tau纤维化，提示NAC域锚定干扰多种底物纤维组装机制；NP-αS^A18C加速αS聚集并强结合αS与tau成熟纤维；纤维形态与二级结构不受共轭物影响。αS功能化增强NPs进入αS凝聚体，但对位点不敏感；共轭物亦可进入异型tau/αS凝聚体并与脂质膜结合而不裂解膜，其中NP-αS^A18C膜亲和性最弱。结果表明共轭位点决定功能输出：A76C抑制纤维化，A18C促进聚集或黏附纤维并降低膜亲和。位点特异性共轭是调控NP–蛋白相互作用的关键设计参数。未来需扩展至寡聚体中间体研究。总体而言，该纳米共轭物可作为探索与调控神经退行性疾病中αS组装的工具。