李斯特菌单核细胞增生亚种 I 类核糖核苷酸还原酶中动力学分化的双锰–酪氨酸自由基辅因子组装

《Biochemistry》：Kinetically Divergent Dimanganese–Tyrosyl Radical Cofactor Assembly in Listeria monocytogenes Class I Ribonucleotide Reductase

　　

核糖核苷酸还原酶（ribonucleotide reductase, RNR）催化核苷酸还原为2′-脱氧核苷酸，是DNA复制与修复所需脱氧核苷酸的唯一从头来源。I类RNR由α₂与β₂两个亚基组成，其中β₂携带启动催化所必需的自由基辅因子。作者研究李斯特菌单核细胞增生亚种（Listeria monocytogenes, Lmo）I类RNR时发现，该酶最有效的生理相关辅因子并非此前推测的二铁–酪氨酸自由基（diferric–Y•），而是由NrdI辅助组装的双锰–酪氨酸自由基（dimanganese–Y•）辅因子。该体系可经锰^II簇、NrdI与O₂形成Mn^IIIMn^IV中间体，再转化为活性辅因子；更重要的是，α₂的存在可使该辅因子组装速率提高10倍以上。结果表明，α亚基不仅参与催化，也可通过促进β亚基辅因子装配来调控RNR活化，对理解Lmo感染过程中铁/锰稳态与毒力具有意义。

核糖核苷酸还原酶（ribonucleotide reductase, RNR）负责将核糖核苷酸还原为2′-脱氧核糖核苷酸，是DNA复制、修复与细胞增殖不可替代的关键酶。I类RNR仅存在于需氧生物，经典观点认为其活性依赖α₂与β₂之间的瞬时装配：β₂中的金属辅因子存储氧化当量并在远距离电子/质子转移过程中启动α₂活性位点自由基化学。既往研究主要关注α₂与β₂在催化阶段的协同及其对寡聚状态的抑制作用，而α₂是否还能通过影响β₂辅因子装配来调节酶活，一直缺乏直接证据。

本研究聚焦李斯特菌单核细胞增生亚种（Listeria monocytogenes, Lmo）这一重要的人体胞内病原体。Lmo仅具有单一的有氧RNR，且其基因簇中编码NrdI样蛋白与硫氧还蛋白样蛋白TrxL，提示其RNR金属辅因子装配可能具有特殊机制。此前该酶被粗略归为I a类，并假设活性辅因子为二铁–酪氨酸自由基（diferric–Y•），但缺乏系统的生化与光谱学证据。作者重新评估后发现，Lmo RNR实际上以双锰–酪氨酸自由基（dimanganese–Y•）辅因子最为活跃，且NrdI参与其组装。该结论不仅修正了该酶的亚类归属，也解释了该蛋白在异源表达时可共纯化出锰的现象。

研究进一步揭示，Lmo β₂在辅因子装配过程中表现出显著异常：锰^II簇与NrdI/O₂反应后形成的Mn^IIIMn^IV中间体向活性双锰–Y•的转化极慢，半衰期约11 min；然而在α₂存在下，这一步骤被加速超过10倍，半衰期降至0.6 min左右。由此可见，α₂可能通过诱导β₂构象变化，在生理条件下同时促进催化与辅因子活化。该发现扩展了RNR活性调控机制，也为理解Lmo在感染过程中对铁过量敏感的现象提供了线索。

作者采用的主要技术方法包括：重组表达与蛋白纯化、金属组成分析、紫外-可见吸收光谱、连续波X波段电子顺磁共振（CW X-band EPR）、氧化还原滴定、酶活测定，以及不同时间点快速淬灭的动力学组装实验；其中蛋白来源为异源表达体系，无临床样本队列。

## 结果

### Lmo RNR Forms Tyrosyl Radical from Diiron and Dimanganese Clusters
作者首先表达并纯化Lmo基因簇中的α、β、NrdI和TrxL。结果显示，β₂在常规条件下共纯化出少量铁、锰与锌，且存在极低水平的酪氨酸自由基信号；但按经典I类RNR方式装配二铁辅因子时，得到的Y•含量低、活性不稳定，提示二铁辅因子不太可能是其生理主要形式。相反，富锰条件下β₂更易获得较高锰占有率，并在NrdI与O₂存在下表现出明显更高活性，提示锰依赖性更强。

### Unusual Electronic Relaxation Behavior of the Dimanganese-Y• Cofactor
在双锰–Y•辅因子形成后，作者通过EPR观察到Lmo体系与已知双锰RNR不同的电子弛豫行为：低温下有机自由基信号难以直接分辨，需在更高温区才能清晰检测到Y•。这一温度依赖性表明，Y•与双锰簇之间可能存在更强的磁耦合，使自由基在低温下显著展宽并快速弛豫。该结果支持活性辅因子确为双锰–酪氨酸自由基形式。

### Slow Tyrosine Oxidation via a MnIII MnIV Intermediate
为明确活性辅因子形成途径，作者对装配反应进行快速淬灭EPR追踪。结果检测到Mn^IIIMn^IV中间体，并显示该中间体随时间衰减、Y•同步生成，两者动力学常数相近，说明该中间体可直接参与酪氨酸氧化并生成活性双锰–Y•辅因子。与其他已知双锰RNR相比，Lmo体系的这一步骤显著更慢。

### Attempts at Heterodinuclear Cluster Assembly in Lmo β
作者进一步测试单锰/锌、锰/铁与铁/锌等异核金属装配可能性。结果显示，Mn/Zn簇虽可形成，但不能被NrdI/O₂激活；Mn/Fe簇可出现部分Mn^IIIFe^III特征，但活性不足以解释主要酶学行为；Fe/Zn体系则不能形成Y•。这些结果进一步排除了二铁辅因子作为主要活性形式的可能性，并强化了双锰辅因子的生理相关性。

### The α Subunit Accelerates Dimanganese Cofactor Assembly
最关键的发现是α₂对辅因子装配的促进作用。作者在反应早期加入α₂、ATP和底物后，发现Y•生成明显加快，且即便不加底物，仅加入α₂与ATP也能显著提升组装速率。说明α₂并非仅在催化时发挥作用，还能促进β₂从Mn^IIIMn^IV中间体向活性双锰–Y•转化。此效应在RNR中属罕见。

## 讨论与结论

作者认为，全部证据共同支持Lmo I类RNR应从原先的I a类重新归入I b类，因为其生理相关辅因子是NrdI依赖的双锰–Y•，而非二铁–Y•。这一修正具有重要方法学意义：仅凭异源表达或低水平铁装配现象不足以判定RNR亚类，必须结合金属依赖性、辅因子稳定性与活化机制综合判断。

论文还指出，Lmo β₂具有三个突出的异常特征：锰^II解离缓慢、双锰–Y•组装极慢、以及双锰簇耦联酪氨酸自由基呈现异常弛豫性质。作者结合结构背景推测，金属结合可能诱导局部螺旋重排，从而造成金属位点高度动力学惰性，并影响金属选择性与辅因子装配效率。尽管这一部分需要进一步结构学验证，但现有结果已表明Lmo RNR的金属装配受严格动力学限制。

更重要的是，α₂显著加速辅因子成熟，提示α-β相互作用不仅调节催化，还可能参与β₂活化过程。这一发现拓展了RNR调控范式，说明亚基互作可在辅因子装配阶段即介入酶活控制。对于Lmo而言，这种机制可能有助于在宿主体内不同铁/锰环境中维持正确金属化，避免铁过量导致的错误装配。作者最终总结，Lmo RNR的独特动力学特征反映了病原菌在感染过程中适应金属稳态波动的策略，也提示2RCC簇其他成员可能存在类似的锰依赖与α依赖装配机制，值得进一步系统研究。