来自结核分枝杆菌的NAD+依赖性去酰化酶Rv1151c（Mt-Sirt）的底物特异性和动力学机制

《Biochemistry》：Substrate Specificity and Kinetic Mechanism of the NAD+-Dependent Deacylase from Mycobacterium tuberculosis, Rv1151c (Mt-Sirt)

　　

通过序列比对和同源建模，研究人员提出，Mt-Sirt（结核分枝杆菌Mtb中唯一的Sir2样赖氨酸去酰化酶）可能具有N_ε-琥珀酰-赖氨酰肽底物的去琥珀酰化酶活性。合成并稳态动力学表征Cbz-N_ε-酰基-赖氨酰-AMC以及一系列含N_ε-酰基-赖氨酰的六肽底物表明，含N_ε-琥珀酰-赖氨酸的底物在所评估的底物中活性最高，并且意外发现含N_ε-酰基-赖氨酰的六肽（其中酰基为肉豆蔻酰基或棕榈酰基）是高效底物。Mt-Sirt的突变分析确定，R56对酶的去琥珀酰化酶活性至关重要，但对短烷基链底物的有效去酰化并非必要。Y53F突变影响酶对琥珀酰和丙酰基底物的活性，提示其酚基可能扰动了有效底物结合和催化所需的关键活性位点残基的构象。已知去乙酰化酶抑制剂烟酰胺（NAM）和腺苷5′-二磷酸核糖（ADPR）对酶产生中等抑制，而NADH是弱抑制剂。然而，制备基于机制的N_ε-酰基硫脲和硫代酰胺类似物提供了更有效的Mt-Sirt抑制剂（IC₅₀ = 2.2–6.8 μM）。研究人员对Mt-Sirt进行了动力学分析，所得曲线符合平衡有序动力学机制，即NAD⁺先快速平衡结合酶，随后N-酰化肽结合。研究人员证明，Mt-Sirt可以催化已知琥珀酰化蛋白Mtb ICL1的去琥珀酰化。为了更好地理解MtICL1赖氨酸琥珀酰化的后果，研究人员评估了MtICL1赖氨酸琥珀酰化模拟物（Lys to Glu），并显示K189E模拟物活性显著降低可能源于活性位点环关闭无效。最后，研究人员使用代谢标记物Alk-12（肉豆蔻酸的炔基类似物）初步评估了Mtb蛋白质组中脂肪酸酰化修饰赖氨酸残基的丰度。使用该探针，研究人员证明Mtb蛋白发生广泛的N_ε-肉豆蔻酰化，提示Mt-Sirt对长链酰基的去酰化酶活性可能在结核分枝杆菌中发挥尚未表征的作用。

结核分枝杆菌（Mtb）通过代谢重塑和翻译后修饰（PTMs）维持宿主内持续感染，但赖氨酸去酰化酶的生化功能尚未充分阐明。目前已知Mtb基因组仅编码一种NAD⁺依赖性去酰化酶Rv1151c（命名为Mt-Sirt），其底物特异性和动力学机制完全不明确。研究人员开展本研究，旨在系统解析Mt-Sirt的催化特性，揭示其在Mtb可逆赖氨酸酰化调控中的潜在作用。论文发表在《Biochemistry》。

主要关键技术方法包括：运用序列比对和AlphaFold同源建模预测活性位点；合成Cbz-N_ε-酰基-赖氨酸-AMC及基于乙酰辅酶A合成酶（ACS）序列的六肽库进行稳态动力学表征；利用定点突变（Y53F和R56M）分析关键残基功能；采用HPLC检测产物生成；通过初始速率、产物抑制和死端抑制实验阐明动力学机制；使用抗琥珀酰赖氨酸抗体进行免疫印迹检测Mt-Sirt对化学琥珀酰化的Mtb异柠檬酸裂合酶1（ICL1）的去修饰作用；并在Mtb减毒株mc27000中利用生物正交探针四癸-13-炔酸（Alk-12）标记与Cy7-叠氮点击化学，结合羟胺处理去除硫酯键，通过凝胶荧光成像评估蛋白质组脂肪酸酰化水平。

**Mt-Sirt Contains an Active Site YxxR Motif**
通过序列比对发现Mt-Sirt含有YxxR基序（Y53和R56），与人类去乙酰化酶5（hSIRT5）及大肠杆菌CobB类似。AlphaFold同源模型叠加显示，其活性位点中R56朝向空腔，而CobB中对应R95在结合乙酰化肽时因疏水排斥而偏离；Mt-Sirt的S37取代CobB的A76，可能阻碍短链疏水酰基底物结合，而L58则类似hSIRT5的V108。提示Mt-Sirt偏好ω-羧基烷基修饰（如琥珀酰）而非短链疏水修饰。

**Mt-Sirt Shows a Preference for N_ε-Succinyl-lysine-Containing Substrates**
使用六种Cbz-N_ε-酰基-赖氨酸-AMC底物进行初步筛选，Mt-Sirt催化所有底物去酰化，但最有效的底物是N_ε-琥珀酰-赖氨酸-AMC（Km = 16.5 μM，k_cat = 0.015 s^-1）。对丙二酰、戊二酰底物活性低下，表明琥珀酰链长提供最佳结合。

**Design and Synthesis of Peptide Substrates Derived from Acetyl CoA Synthetase**
基于ACS中K617位点（-RSGKIMR-）设计六肽Ac-RSGKAcylIW-OH，引入不同酰基修饰以系统评估底物多样性。

**Mt-Sirt Exerts Robust Lysine Desuccinylase and Fatty-Acid Deacylase Activity**
对15种六肽底物的稳态动力学分析显示，N_ε-琥珀酰-赖氨酸底物催化效率最高（k_cat/K_m = 3.8 × 10³ M^-1s^-1）。长链脂肪酸酰基（辛酰基至棕榈酰基）底物的k_cat/K_m随链长线性增加（R² = 0.95），棕榈酰基底物达2.0 × 10³ M^-1s^-1。N_ε-生物素酰基底物无活性，表明偏好线性长链修饰。突变实验证实R56是琥珀酰底物结合的关键；Y53F突变使琥珀酰底物k_cat/K_m下降11.9倍，丙酰底物下降6.3倍，证明Y53同时参与结合与催化。

**Product, Substrate Analog, and Mechanism-Based Inhibition of Mt-Sirt**
烟酰胺（NAM）对Mt-Sirt中等抑制（IC₅₀ = 530 μM），ADPR弱抑制（IC₅₀ = 3.0 mM），NADH无显著抑制。基于机制的硫脲类似物中，肉豆蔻酰硫脲类似物（4）IC₅₀ = 6.8 μM；将硫代肉豆蔻酰赖氨酸嵌入ACS六肽骨架（5）获得最强抑制（IC₅₀ = 2.2 μM），且呈竞争性抑制（K_is = 4.8 μM）。但所有硫代酰胺/硫脲抑制剂均存在残余活性，表明可发生去硫代酰化。

**Kinetic Mechanism of Mt-Sirt**
以Ac-RSGKSuccIW-OH和NAD⁺为底物的初始速率双倒数图呈相交模式，且当固定NAD⁺可变肽时线交于纵轴，拟合至平衡有序机制方程最优（K_iNAD = 1300 μM，K_肽 = 30 μM）。产物抑制（NAM vs 肽为非竞争性）及死端抑制（Cbz-Lys-AMC vs NAD⁺为反竞争性）进一步支持NAD⁺先快速平衡结合肽后结合的有序机制。

**Nε-Succinylated MtICL1 is a Substrate of Mt-Sirt and an MtICL1 Succinylation Mimic Exhibits Altered Loop Closure**
化学琥珀酰化的Mtb ICL1与Mt-Sirt共孵育后，免疫印迹显示琥珀酰基几乎完全去除。琥珀酰化模拟突变K189E导致MTICL1催化效率下降约4.5 × 10⁴倍（k_cat/K_m从4.3 × 10⁵ M^-1s^-1降至9.5 M^-1s^-1），而K322E和K334E影响较小。内源色氨酸荧光实验表明，K189E突变体在底物存在下无明显荧光猝灭，且热稳定性降低，提示活性位点环关闭受阻，而底物结合能力未丧失。

**Fatty Acid Acylation of Proteins Occurs in the Mtb Proteome**
在Mtb减毒株mc27000中培养添加Alk-12后，结合生物正交标记与凝胶荧光成像，发现大量蛋白被Alk-12修饰，表明Mtb蛋白质组存在广泛的N_ε-脂肪酸酰化（特别是肉豆蔻酰化），提示Mt-Sirt的长链脂肪酸去酰化酶活性可能在体内调控这些未知修饰。

论文结论部分：通过序列比对和同源建模，研究人员提出Mt-Sirt可能具有N_ε-琥珀酰-赖氨酰肽的去琥珀酰化酶活性。合成并稳态动力学表征Cbz-N_ε-酰基-赖氨酰-AMC及六肽底物库，证明含N_ε-琥珀酰-赖氨酸的底物活性最高，并且意外发现肉豆蔻酰基或棕榈酰基的六肽是高效底物。突变分析鉴定R56对去琥珀酰化酶活性至关重要，而Y53F突变影响琥珀酰和丙酰底物的活性。已知抑制剂NAM和ADPR产生中等抑制，NADH弱抑制；基于机制的N_ε-酰基硫脲和硫代酰胺类似物提供更有效抑制（IC₅₀ = 2.2–6.8 μM）。动力学分析表明Mt-Sirt遵循平衡有序机制，NAD⁺先快速平衡结合，随后N-酰化肽结合。研究人员证明Mt-Sirt可以催化琥珀酰化的Mtb ICL1的去琥珀酰化，且K189E模拟突变导致活性显著降低，可能源于活性位点环关闭无效。最后，利用Alk-12探针证明Mtb蛋白质组存在广泛N_ε-肉豆蔻酰化，提示Mt-Sirt对长链酰基的去酰化酶活性在Mtb中可能发挥尚未表征的作用。