《Journal of Biological Chemistry》：The structure of the SufBC2D-SufE complex reveals the mechanism of sulfur transfer in bacterial Fe-S cluster assembly
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铁硫（Fe-S）簇是细菌中通过Suf途径经由一系列瞬时蛋白质-蛋白质相互作用而组装的关键辅因子，这些相互作用将硫从L-半胱氨酸转移至支架复合物。虽然过硫化物转移的早期步骤已得到充分表征，但硫向SufBC2D支架递送的机制仍未解决。在此，研究人员报告了SufBC
铁硫（Fe-S）簇是细菌中通过Suf途径经由一系列瞬时蛋白质-蛋白质相互作用而组装的关键辅因子，这些相互作用将硫从L-半胱氨酸转移至支架复合物。虽然过硫化物转移的早期步骤已得到充分表征，但硫向SufBC2D支架递送的机制仍未解决。在此，研究人员报告了SufBC2D-SufE复合物的首个结构，捕获了Suf途径中过硫化物转移的最后一步。该结构揭示了SufB和SufE中协调的构象变化，这些变化暴露了SufB上原本埋藏的C254受体位点，并将SufE C51环定位在SufB-SufD轴下方。生化分析表明，SufB全局保守的220s β链（β-strand）上的取代增强了SufE结合亲和力和过硫化物转移速率，与稳定局部重排的转移胜任构象一致。总之，这些结果支持一个模型，其中构象门控（conformational gating）调节过硫化物转移，为控制对活性硫中间体的可及性提供了机制。
**研究背景与问题**
铁硫簇（Fe-S簇）是细菌中至关重要的金属辅因子，参与细胞呼吸、DNA复制和信号传导等核心生物过程。在细菌中，Fe-S簇的组装主要通过铁硫簇（Isc）途径和Suf途径完成。Isc途径研究较为深入，其半胱氨酸脱硫酶IscS与支架蛋白IscU直接形成复合物，实现过硫化物的直接转移。然而，在细菌中更为普遍的Suf途径中，硫转移机制存在显著差异：Suf途径利用半胱氨酸脱硫酶SufS产生过硫化物，但该中间体并非直接传递给SufBC2D支架复合物，而是需要转运蛋白SufE（或SufU）作为中间载体，依次从SufS接收过硫化物并传递给SufB亚基。尽管SufS到SufE的转移步骤已有结构生物学和生化表征，但SufE如何将过硫化物递送至SufBC2D支架的机制长期未解。由于Suf途径在包括人类病原菌在内的多种细菌中不可或缺，阐明其分子机制对于开发新型抗生素具有重要意义。
**研究内容与结论**
研究人员通过序列相似性网络分析，发现SufB亚基上有一保守的220s β链区域，其中Y224、R226、N228等残基在进化中高度保守。通过定点突变引入丙氨酸替换，并利用过硫化物转移动力学分析、荧光偏振结合实验和厌氧Fe-S簇重构实验，证明Y224A、R226A和N228A突变体增强了SufE的结合亲和力（KD值从2-3 μM降至0.2-0.5 μM）并提高了过硫化物转移速率（约25-30%），同时不影响Fe-S簇体外组装功能。基于这些突变体稳定了SufBC2D与SufE的相互作用，研究人员利用冷冻电镜（cryo-EM）解析了Y224A SufBC2D与SufE复合物的结构，分辨率达4.2 ?。该结构首次揭示了SufE与SufB的相互作用界面：SufE的C51环从闭合构象转变为伸展构象，将C51定位至SufB-SufD轴下方；SufB的220s β链发生局部重排，使原本包埋于β三明治中的C254残基旋转至溶剂可及位置，与C51相距约8 ?，形成有利于过硫化物转移的构象。这些发现支持一个模型，即SufB和SufE的协同构象变化构成构象门控机制，严格调控过硫化物转移，确保反应性硫中间体的定向传递。
该论文发表在《Journal of Biological Chemistry》。
**关键技术方法**
研究采用以下主要技术方法：序列相似性网络生成（EFI-EST工具，用于构建SufB序列保守性分析）；定点突变（引入SufB亚基的丙氨酸替换）；过硫化物转移动力学分析（亚甲基蓝法，定量检测硫化物生成速率）；荧光偏振结合实验（BODIPY-FL标记SufE C51A/E107C突变体，测定SufE与SufBC2D的结合亲和力）；厌氧Fe-S簇重构实验（监测420 nm吸光度变化，评估簇组装动力学）；冷冻电镜单颗粒分析（Glacios 2冷冻电镜，Falcon 4i直接电子探测器，数据经cryoSPARC处理，并利用AlphaFold3模型辅助建模）。样本来源为大肠杆菌BL21(DE3)Δsuf细胞，用于表达重组SufBC2D及其突变体。
**研究结果**
**Mapping of conserved surface residues on SufB**
通过EFI-EST构建序列相似性网络，识别出SufB上全局保守的220s β链区域（残基224-228），该区域位于C254附近的外部表面，Y224、R226和N228在进化中高度保守，提示其可能参与SufE相互作用。
**Kinetic characterization of persulfide transfer from SufS to SufBC2D variants**
利用亚甲基蓝法测定过硫化物转移速率，发现Y224A、R226A和N228A突变体使SufS激活的硫化物生成速率提高约25-30%，而F225A和I227A突变体仅产生微弱效应，表明这些残基特异性稳定了SufB的转移胜任构象。
**Fluorescence polarization binding assays**
荧光偏振结合实验显示，Y224A、R226A和N228A突变体对SufE的结合亲和力显著增强（KD值从约2.5 μM降至0.2-0.5 μM），与过硫化物转移速率的增加呈正相关，支持这些突变体稳定了SufBC2D与SufE的有效复合物。
**SufB variants are not deficient in DTT-dependent Fe-S cluster assembly**
厌氧簇组装实验表明，在DTT条件下，Y224A、R226A和N228A突变体与野生型SufBC2D的簇组装动力学几乎一致，而C254A突变体完全丧失组装能力，说明这些突变体的功能缺陷并非由于全局性支架功能受损，而是特异性地影响过硫化物转移步骤。
**Cryogenic-electron microscopy captures the SufBC2D-E complex**
冷冻电镜解析Y224A SufBC2D与SufE复合物的结构，分辨率4.21 ?。结构显示：SufE的C51环从闭合构象转变为伸展构象，C51残基指向SufB；SufB的220s β链发生局部重排，使C254从β三明治内部旋转至暴露位置；C51与C254硫原子间距约8 ?，处于过硫化物转移距离内。此外，SufE的R119朝向SufB的C端螺旋，与酸性残基相互作用，可能促进C51环的释放。
**讨论与结论**
讨论部分指出，SufE向SufBC2D的过硫化物转移依赖于SufB和SufE的协同构象变化：SufB的220s β链重排暴露C254，SufE的C51环伸展使其定位至转移位点。该机制与SufS-SufE复合物中观察到的构象门控特征相似，但相互作用界面非重叠，避免了三元复合物形成，确保了硫的定向传递。研究还发现，SufB的220s β链突变体（Y224A等）稳定了转移胜任构象，但体外簇组装正常，与体内必需性矛盾，可能源于体内存在ATP水解等额外调控因素。结论部分翻译如下：
Suf途径细菌Fe-S簇组装的分子机制表征仍是一个重要且未被充分研究的领域，尤其与更明确的Isc途径相比。此处，SufBC2D-SufE复合物的首个结构定义了如何通过SufB和SufE的协调构象变化实现过硫化物向支架的转移。这些构象变化暴露了SufB上原本埋藏的C254受体位点，并促进SufE C51环的伸展，从而在簇组装前实现有效转移。结构与生化数据的整合支持一个模型，其中过硫化物转移受供体和受体蛋白的构象门控调控，为控制反应性硫中间体的可及性提供了机制。该门控机制提供了一种在缺乏稳定三元复合物的途径中强制定向硫转移的手段，将先前为SufS-SufE相互作用建立的原则扩展到SufE-SufBC2D步骤。未来研究将聚焦于SufE的过硫化物转移如何与后续SufBC2D催化的Fe-S簇组装步骤整合，包括ATP依赖的SufC动力学、铁掺入、黄素氧化还原化学，以及SufU依赖的Suf途径中转运机制的比较。
