N末端半胱氨酸介导的替代性胞外二硫键形成支持嗅觉受体的功能性表达

《Journal of Biological Chemistry》：Alternative Extracellular Disulfide Bond Formation by N-terminal Cysteines Supports Functional Expression of Odorant Receptors

　　

哺乳动物嗅觉受体(odorant receptors, ORs)是G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)大家族的一员，依赖保守的分子内二硫键进行正确折叠和发挥功能。然而，一些ORs缺乏胞外环2(extracellular loop 2, ECL2)中的典型半胱氨酸，这引发了关于替代性结构稳定机制的疑问。在此，研究人员识别并表征了OR51E2(第一个具有实验解析结构的哺乳动物OR)中一个独特的N末端半胱氨酸与ECL2半胱氨酸之间的非常规二硫键。通过异源细胞中的突变发生和功能检测，研究人员证明了该N末端半胱氨酸对于受体表面表达和配体响应至关重要。此外，AlphaFold2结构预测与实验数据相一致，表明替代性二硫键有助于受体稳定性。这些发现揭示了ORs中灵活的二硫键形成策略，表明替代性胞外半胱氨酸连接可以补偿缺失的保守键，从而支持受体折叠和GPCR家族内的功能多样化。

**论文解读：N末端半胱氨酸介导的替代性二硫键在嗅觉受体功能表达中的作用**

**研究背景**
嗅觉受体(odorant receptors, ORs)是哺乳动物最大的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor, GPCR)家族，在人类和小鼠中分别约有400和1100个成员，通过识别多样气味物质介导嗅觉感知。ORs属于A类GPCR，具有七个跨膜结构域、胞外N末端、胞内C末端和三个胞外环(extracellular loops, ECLs)。正确折叠对ORs的功能表达至关重要，其中分子内二硫键是关键结构稳定机制。在经典A类GPCR中，保守的二硫键连接跨膜螺旋3(TM3)的Cys^3.25与ECL2的Cys^45.50，确保正确结构形成。此外，ORs在ECL2中还有两个保守半胱氨酸(Cys^45.40和Cys^45.60)形成的第二个二硫键，稳定受体三维结构，对配体识别和激活至关重要。然而，部分ORs缺少ECL2中的保守半胱氨酸，其结构稳定机制尚不清楚。OR51E2是首个且唯一具有实验解析结构(冷冻电镜)的天然OR，其结构中存在N末端半胱氨酸(Cys⁴)与ECL2半胱氨酸(Cys¹⁶⁸)形成的二硫键，提示可能存在替代性结构稳定策略。基于此，研究人员系统研究了ORs中N末端半胱氨酸在分子内二硫键形成中的作用及其对受体功能表达的影响。

**研究目的与结论**
本研究旨在阐明ORs中N末端半胱氨酸参与的非常规二硫键对受体折叠和功能表达的意义。研究人员综合利用序列分析、结构预测、定点突变和异源细胞功能检测，证明N末端半胱氨酸是OR51E2表面表达和配体响应的关键残基，且其位置具有优化依赖性；在OR51E1中引入N末端半胱氨酸可补偿缺失的保守ECL2二硫键；小鼠Or8w1中存在第三个由N末端半胱氨酸与ECL2形成的分子内二硫键。这些发现揭示ORs中灵活的替代性二硫键策略，该策略通过补偿保守键缺失支持受体折叠和功能多样化，为理解GPCR家族结构-功能关系提供新视角。论文发表在《Journal of Biological Chemistry》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用以下关键技术：1）利用GPCRdb和HORDE数据库进行非OR GPCR及OR序列分析，通过MAFFT多重序列比对和IQ-TREE系统发育树分析考察N末端半胱氨酸的进化分布；2）借助AlphaFold2和AlphaFold3进行蛋白质结构预测，评估N末端半胱氨酸与胞外结构域二硫键的形成；3）采用流式细胞术检测异源细胞(HEK293T细胞和Hana3A细胞)中受体的细胞表面表达水平；4）通过Glosensor cAMP检测方法测量配体诱导的cAMP积累，评估受体功能活性；5）使用PyMOL软件进行结构模型可视化和对比分析。样本来源包括GPCRdb中289个人类非OR A类GPCR序列及HORDE数据库中390个人类OR和1143个小鼠OR序列，同时使用NCBI BLAST获得OR51E2和OR51E1直系同源序列。

**研究结果**

**Prediction of Intramolecular Disulfide Bond Involving N-terminal Cysteine in Human Class A GPCRs**
通过序列和结构分析发现，289个人类非OR A类GPCR中146个(50.5%)在N末端含至少一个半胱氨酸。AlphaFold2预测显示其中86个(58.9%)的N末端半胱氨酸与胞外区另一个半胱氨酸形成二硫键，包括与ECL2、TM3、TM5、TM7等不同位置的连接。与实验结构(PDB数据)对比，30个受体(77%)的预测二硫键模式与实验一致。系统发育分析表明，N末端二硫键在特定家族(如TAARs和CCRs)中保守，但在许多家族中呈零星分布，提示该结构特征在进化中独立出现多次。

**Analysis of N-terminal Disulfide Bonds in Class B GPCRs**
对B类GPCR的分析未发现预测的N末端与ECL2的二硫键，这与A类GPCR的特征形成对比。

**Predicted N-terminal disulfide bonds in odorant receptors**
在390个人类OR中，36个(9.2%)含N末端半胱氨酸，其中12个被预测形成N末端与ECL之间的分子内二硫键。根据ECL2保守半胱氨酸的缺失模式，形成四种替代性二硫键类型：缺乏Cys^45.60的OR(如OR51E2)中N末端半胱氨酸与Cys^45.40连接；缺乏Cys^45.40的OR(如OR52M1)中与Cys^45.60连接；含全部三个保守半胱氨酸的OR56A家族出现第三个二硫键(N末端与Cys^45.48)；其余24个OR保留典型三个保守半胱氨酸但不形成额外二硫键。小鼠OR中113个(9.9%)含N末端半胱氨酸，其中10个人类OR的小鼠直系同源或近缘受体具有对应二硫键连接，表明该结构特征在哺乳动物进化中部分保守。

**Importance of N-terminal Cysteine in OR51E2**
基于OR51E2冷冻电镜结构(PDB: 8F76)与AlphaFold2模型的比对，确认了Cys⁴与Cys¹⁶⁸之间二硫键的形成。保守性分析显示，所有哺乳动物OR51E2直系同源中Cys⁴和Cys¹⁶⁸均保守，而BW45.60位点从不含半胱氨酸。通过突变实验，C4S和C168S突变体在HEK293T细胞中表面表达显著降低且丧失对丙酸的激动剂响应，证明这两个半胱氨酸对功能至关重要。Y188C单突变不影响表面表达但降低响应。引人注目的是，C4S+Y188C双突变体(将Y188突变为半胱氨酸)恢复了表面表达并部分恢复响应，AlphaFold3模型预测该双突变体在Cys¹⁶⁸和Cys¹⁸⁸间形成二硫键，整体结构与野生型高度相似(RMSD=0.148 ?)。结果表明，OR51E2中Cys⁴与Cys¹⁶⁸的二硫键是受体正确折叠和功能表达所必需的。

**Cysteine Position Dependency in the N-Terminal Region of OR51E2**
为检验N末端半胱氨酸位置是否优化，研究人员构建了半胱氨酸位置转移的突变体(将C4S与S2C、S3C、N5C、F6C、T7C、H8C等组合)。流式细胞术分析显示，S2C+C4S、S3C+C4S、C4S+F6C和C4S+T7C突变体实现显著膜定位(但低于野生型)，而C4S+H8C无膜定位。剂量-响应分析表明，具有膜定位的突变体激动剂响应水平与野生型相当，且膜定位与响应强度呈正相关(Spearman r=0.89, p<0.001)。C4S+N5C突变体因失去N5糖基化位点而无法定位。结构预测显示，半胱氨酸位于第2至7位时均可与Cys¹⁶⁸形成二硫键，而第8位则不能。结论：Cys⁴是OR51E2功能表达的最优位置，该二硫键对受体功能至关重要。

**N-terminal Cysteine Compensates for the loss of a Conserved Intramolecular disulfide bond**
为验证N末端半胱氨酸能否补偿保守二硫键缺失，研究人员以OR51E1为模型(具有典型保守ECL2二硫键Cys¹⁷²-Cys¹⁹¹)。将C191突变为酪氨酸(C191Y)后表面表达显著降低。在此基础上，在N末端不同位置引入半胱氨酸构建十个突变体，评估其功能恢复。N5C+C191Y和E8C+C191Y突变体恢复了表面表达和激动剂响应(异戊酸)，且膜定位与响应强度呈正相关(Spearman r=0.92, p<0.001)。AlphaFold3预测显示，恢复功能的突变体中引入的半胱氨酸与Cys¹⁷²形成二硫键。结果表明，在N末端引入半胱氨酸可稳定N末端与ECL2间的结构，补偿ECL2内二硫键缺失并恢复功能表达。

**The importance of third intramolecular Disulfide Bond in the Mouse OR**
针对小鼠Or8w1(Olfr1132, 响应2-甲基-2-噻唑啉)，AlphaFold3预测其N末端Cys⁶与ECL2的Cys¹⁶⁷形成第三个二硫键(除保守的Cys⁹⁷-Cys¹⁶⁹和Cys¹⁷⁹-Cys¹⁸⁷外)。C6S和C167S突变体在HEK293T细胞中对2-甲基-2-噻唑啉的响应显著降低，C6S表面表达与野生型相当而C167S明显降低，提示该第三二硫键主要影响受体响应能力而非膜运输。通过将半胱氨酸在N末端不同位置重定位(K3C、K4C、N5C、S7C等)，发现部分突变可恢复响应，且恢复功能的突变体中形成新的N末端-ECL2二硫键(C4-C167或C6-C167等)。结构预测显示，C6S突变增加N末端与ECL2距离，而恢复突变则重建二硫键。结论：Or8w1中N末端半胱氨酸与Cys¹⁶⁷的二硫键是功能表达所必需的。

**总结与讨论**
本研究揭示，ORs中部分受体利用N末端半胱氨酸形成替代性分子内二硫键以补偿保守ECL2二硫键的缺失，从而支持受体折叠和功能表达。这种策略在进化中独立出现多次，在ORs和部分非OR A类GPCR中均有发现。研究还表明，N末端半胱氨酸的位置对功能表达至关重要，其优化位点(如OR51E2的Cys⁴)可能受到选择压力。尽管通过引入半胱氨酸可部分恢复功能，但并非完全恢复，说明替代二硫键具有特异性要求。此外，部分突变体在保持表面表达的情况下改变响应能力，提示胞外二硫键可能影响受体构象、激活态稳定或胞外区域与跨膜核心的耦合。当前存在局限性：缺乏直接生化证据证明二硫键形成、不能区分响应差异源于配体结合还是G蛋白偶联、以及无法捕捉受体群体的异质性。未来需进一步开展直接二硫键定位、时间分辨分析和氧化还原敏感性研究。

**研究结论翻译**
总之，本研究识别了一种涉及N末端结构域的替代性分子内二硫键策略，该策略有助于ORs(可能也包括其他GPCR)的功能表达和多样化。这些发现表明，胞外二硫键连接方式的变异为OR进化提供了结构和功能上的灵活性。我们的研究为研究和工程化功能性GPCR提供了新途径，并可能有助于克服OR表达和表征中的主要障碍。