《Journal of Chromatography A》：Isomer-specific separation and analysis of 42 bile acids in intestinal contents using ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
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邓凌宇|张静静|纪康|张旭|贾彦军|文龙霞|胡芳迪•UPLC-MS/MS技术可定量检测42种胆酸，能够区分11个类别中的35种异构体。•大多数胆酸异构体之间具有良好的分离度，提升了检测的特异性。•通过冻干和复合溶剂萃取可实现快速的样品预处理。•经过全面验证，该方法的线性、灵敏度、
邓凌宇|张静静|纪康|张旭|贾彦军|文龙霞|胡芳迪
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UPLC-MS/MS技术可定量检测42种胆酸，能够区分11个类别中的35种异构体。
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大多数胆酸异构体之间具有良好的分离度，提升了检测的特异性。
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通过冻干和复合溶剂萃取可实现快速的样品预处理。
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经过全面验证，该方法的线性、灵敏度、准确度和精密度均表现优异。
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利用该方法可检测慢性不可预测轻微应激模型与正常模型中14种差异性的肠道胆酸。
引言
胆酸是肝脏中胆固醇代谢产物通过“经典途径”和“替代途径”产生的最终产物，最初形成的胆酸包括胆酸和鹅脱氧胆酸，随后它们会与甘氨酸或牛磺酸结合[[1], [2], [3]]。进入肠道后，这些结合型胆酸会被肠道微生物分解为游离胆酸，进而进一步转化为脱氧胆酸和石胆酸等二级胆酸，从而形成复杂的代谢网络[4]。作为“肠肝轴”的关键信号分子，胆酸不仅有助于脂质的消化和吸收，还能通过激活法尼醇X受体和G蛋白偶联受体TGR5等核受体，调节葡萄糖和脂质代谢、能量平衡以及免疫反应，因此与多种疾病的发病机制密切相关[5,6]。因此，准确测定生物样本中的胆酸含量对于阐明相关疾病机制至关重要。
鉴于胆酸在生理和病理过程中的重要作用，建立准确高效的定性和定量分析方法十分必要。目前，大多数研究仅关注生物液体中有限的几种胆酸种类[[7], [8], [9], [10], [11], [12], [13]]，而针对直接反映肠道内代谢状况及宿主与微生物相互作用的肠道内容物的研究则相对较少[14]。虽然有一些方法可用于检测粪便等复杂样本中的胆酸，但它们的灵敏度和检测范围较差，难以准确测定如熊去氧胆酸这类微量胆酸[15,16]。此外，硫酸化胆酸和葡萄糖醛酸化胆酸也值得关注：在健康人群中，尿液中的胆酸有高达89%为硫酸化胆酸[17]，而胆酸葡萄糖醛酸衍生物则是肝脏疾病的重要指标[18]。尤为关键的是，众多胆酸异构体的存在给胆酸定量分析带来了很大挑战，需要在分析时间和分离能力之间找到平衡[[19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28]]。
为解决这些难题，本研究采用基于冻干和复合溶剂萃取的快速样品预处理方法，并结合“以异构体为导向的协同整体响应”色谱优化策略，旨在建立一种快速、准确且可靠的超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法，用于检测包含11个类别、35种异构体的42种胆酸。通过全面的 方法验证，并将该方法应用于慢性不可预测轻微应激诱导抑郁大鼠模型的肠道内容物分析，本研究为发现与抑郁相关的生物标志物提供了技术支持。
章节要点
标准品与试剂
共46种胆酸及内部标准参考物质（结构见图1）由天津阿尔塔科技有限公司提供：脱氢石胆酸、异硬脂酸胆酸、硬脂酸胆酸、石胆酸、去甲脱氧胆酸、6-酮石胆酸、无胆酸、3β-熊去氧胆酸、异羟基脱氧胆酸、熊去氧胆酸、羟基脱氧胆酸等。
方法开发与优化
经过系统的开发与优化，最终可使用UPLC-MS/MS技术定量检测42种胆酸。实验采用了CORTECSTM Premier T3色谱柱（1.6 μm，2.1毫米×150毫米），色谱柱温度设定为35°C。流动相为含0.01%甲酸的水（溶剂A）和乙腈（溶剂B）。梯度洗脱的起始流速为0.25毫升/分钟，溶剂B的比例为35%，1.5分钟内比例上升至42%；5分钟内流速降至0.2毫升/分钟，溶剂B的比例继续上升至65%。
讨论
本研究比较了正离子模式和负离子模式，发现负离子模式更适用于胆酸的检测。对于游离胆酸，即使在高碰撞能量作用下也无法产生稳定的碎裂离子，因此采用产物离子与前体离子相同的伪MRM过渡峰进行监测。而对于结合型胆酸，虽然C24位置的甘氨酸或牛磺酸基团在碰撞能量作用下容易发生断裂，不过也有部分文献报道……
结论
本研究通过采用针对特定异构体的分离策略以及基于整体响应的优化方法，建立了一种灵敏度高且准确的UPLC-MS/MS定量分析方法。该方法能够高效地同时检测生物样本中的42种胆酸，即11个类别中的35种异构体。该方法已被成功应用于检测患有抑郁的SD大鼠肠道中的胆酸，证明了其在胆酸定量分析方面的出色灵敏度和准确性。
CRediT作者贡献说明
邓凌宇：论文撰写——初稿、可视化分析、方法验证、方法学设计、实验研究、正式分析、数据整理。 张静静：方法验证、正式分析。 纪康：方法验证、方法学设计、正式分析。 张旭：方法验证、正式分析。 贾彦军：实验研究、正式分析。 文龙霞：方法验证、正式分析。 胡芳迪：论文撰写——审阅与编辑、可视化分析、项目监督、资源协调、方法学设计、资金获取、研究构思。
