一种用于测定70种偶氮染料衍生的伯芳香胺以评估从染色纺织品中迁移的HPLC-MS/MS多分析物方法

《Journal of Chromatography A》：An HPLC-MS/MS multi-analyte method for the determination of 70 azo dye-derived primary aromatic amines for the assessment of migration from dyed textiles

　　

• 同时测定59种（ESI⁺）和11种（ESI^-）伯芳香胺（PAAs）。
• 简单、快速、资源高效的方法，便于常规分析应用。
• 定量限（LOQs）：每千克纺织品释放的PAA为0.003?9 mg。
• 区分迁移的PAA污染物和从偶氮染料释放的PAA。
• 应用于分析来自83个市场样品在汗液模拟液中的PAA迁移。

**论文解读：基于HPLC-MS/MS的多分析物方法用于测定染色纺织品中70种偶氮染料衍生伯芳香胺的迁移**

**研究背景与问题**
纺织品作为日常接触消费品（如衣物、床单、座椅套等），与皮肤接触时间可达24小时/天。偶氮染料因其易生产、耐久性和颜色多样性，占工业染料用量超过70%。然而，偶氮染料在合成过程中可能残留伯芳香胺（Primary Aromatic Amines, PAAs）作为杂质，或在还原条件下（如皮肤微生物还原）裂解释放PAAs。部分PAAs具有致癌性和/或致突变性，欧盟REACH法规（附件XVII，第43条，附录8）限制22种特定PAAs在纺织品和皮革制品中的含量不得超过30 mg/kg。现有检测方法（如DIN EN 14362-1）涉及染料提取、还原裂解及硅藻土净化，但该方法耗时长、溶剂消耗大，且部分PAA回收率低至20%，灵敏度受限。此外，现有方法无法区分迁移的PAA污染物与偶氮染料还原释放的PAA，且对极性PAAs和含硝基/偶氮基团的PAAs覆盖不足。因此，研究人员旨在开发一种简单、快速、高灵敏度的多分析物方法，用于同时测定70种PAAs，并应用于评估实际纺织品迁移行为，以获得更真实的经皮暴露数据。论文发表在《Journal of Chromatography A》。

**关键技术方法**
研究人员使用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）技术，配备电喷雾电离（Electrospray Ionization, ESI）正负离子模式。色谱分离采用Kinetex Biphenyl色谱柱（100 ?, 2.6 μm, 100 × 2.1 mm），以水（A）和甲醇（B，含0.01%甲酸）为流动相进行梯度洗脱。样品前处理无需提取或净化，仅需稀释后直接进样，通过在线盐分离（前2分钟切换废液）去除缓冲盐和还原剂。还原步骤采用改良条件（4.1 mg/mL连二亚硫酸钠，室温15 min）以保持分析物稳定性。方法依据DIN 32645和信噪比确定定量限，并评估了精密度和回收率。样本来源为2023年从德国四家大型零售商在线购买的83件棉含量≥90%的纺织品，迁移实验在汗液模拟液（pH 8，37°C，24 h，50 rpm）中进行。

**研究结果**

**3.1. 选择性**
- **3.1.1. 不同洗脱剂改性剂对质谱灵敏度和色谱保留的影响**：研究人员发现，洗脱剂中添加5 mM乙酸铵会强烈抑制多数PAAs的信号（最高达100倍），因此未使用铵盐。使用0.01%甲酸作为改性剂（洗脱剂B），使4-羟基苯胺、苯二胺（PDAs）和甲基苯胺异构体获得充分保留和分离，而5种PAAs因保留时间不足或灵敏度低被排除验证。
- **3.1.2. 芳基二胺的峰形**：在非还原方法中，1,4-苯二胺（1,4-PDA）衍生物出现宽峰或无法检测，而还原方法中峰形尖锐。研究表明，保持还原条件（封闭体系、低温）可维持良好峰形和灵敏度。
- **3.1.3. 分析物分离**：优化后的色谱条件实现了所有59种ESI⁺ PAAs（含异构体）和11种ESI^- PAAs的有效分离，包括易还原降解的硝基/偶氮类PAAs。

**3.2. 还原过程中的分析物稳定性和硅藻土净化后的回收率**
与DIN EN ISO 14362-1相比，改良还原条件（低浓度连二亚硫酸钠、室温）下，4-氨基偶氮苯（模型偶氮染料）完全还原，裂解产物苯胺回收率≥102%。在冷却的还原基质中，不含硝基/偶氮基团的PAAs在12小时内稳定（回收率93–113%）。而硅藻土净化步骤导致约三分之一的PAAs回收率低于20%，无任何PAA超过70%，因此研究人员开发了无提取的前处理方法。

**3.3. 迁移过程中分析物的稳定性**
在迁移条件（汗液模拟液，37°C，24 h）下，53种PAAs回收率超过90%，但14种PAAs低于80%，如4-甲氧基-1,3-苯二胺和4-甲氧基苯-1,2-二胺完全降解。含硝基/偶氮基团的PAAs回收率≥95%。

**3.4. 工作范围、定量限和精密度**
方法的线性工作范围通常为0.135–202.5 μg/L，对应纺织品迁移量0.03–45 mg/kg。基于DIN 32645的定量限（LOQs）为0.014–40.5 μg/L（还原方法中29种PAA ≤0.135 μg/L，非还原方法中42种PAA ≤0.135 μg/L）。重复性良好，非还原方法相对标准偏差（RSD）平均4%，还原方法平均3%，操作者间变异系数平均4%。

**3.5. 市场样品中PAAs和偶氮染料的迁移测定及与还原可提取含量的比较**
- **3.5.1. REACH列出的PAAs的迁移**：在83个样品中，3个样品检测出4,4′-二氨基二苯甲烷（低于LOQ），4个样品检测出4-氯苯胺（最高0.023 μg/dm²），而样品#2在还原后检测出0.032 μg/dm² 4-氯苯胺（来源于偶氮染料）。所有迁移量均远低于REACH限值。
- **3.5.2. 非REACH列出的PAAs的迁移**：5-氨基-2-氯甲苯-4-磺酸在样品#8中迁移量为0.216 μg/dm²，还原后增加12.7倍（2.74 μg/dm²）。2-氨基苯磺酸在样品#9（红色Polo衫）中迁移量高达40.8 μg/dm²（17.3 mg/kg），还原后仅增加23%，表明主要来自染料合成杂质。所有牛仔裤样品中检测到苯胺（0.083–0.334 μg/dm²），来源于靛蓝染料污染。
- **3.5.3. REACH列出的PAAs的可还原提取含量**：对12个样品按DIN EN 14362-1进行还原提取，未发现超过30 mg/kg限值的样品。最常检测到的是4-氯苯胺（10/12样品，最高2.1 mg/kg）和3,3′-二氯联苯胺（最高0.4 mg/kg）。
- **3.5.4. 非REACH列出的PAAs的可还原提取含量**：2-氨基苯磺酸在样品#9中提取含量达971 mg/kg，5-氨基-2-氯甲苯-4-磺酸为3.2 mg/kg，苯胺最高32 mg/kg。这些极性PAAs在硅藻土净化中无法检测，而直接稀释法成功定量。迁移分数因分析物而异，低提取含量样品迁移分数较高（10–56%），高提取含量样品迁移分数较低（<0.1–2%）。

**讨论总结与结论翻译**
讨论部分强调，该方法通过无提取前处理克服了回收率低的问题，在线盐去除是关键；色谱优化实现了异构体分离，可区分REACH列出的和非列出的PAAs；灵敏度高于现有方法，适用于精确迁移评估。市场样品分析显示，REACH列出的PAAs迁移量极低（约0.01–0.059 μg/dm²），但非列出的PAAs如2-氨基苯磺酸迁移量显著（最高50.3 μg/dm²）。红、黑色纺织品常观察到明显颜色迁移，表明存在未被该方法覆盖的偶氮染料可裂解亚结构。翻译结论部分如下：
“在本研究中，研究人员提出了一种灵敏的多分析物方法，用于通过HPLC-MS/MS测定汗液模拟液中的70种PAAs。该方法可表征来自染色纺织品的偶氮染料和潜在PAA污染物的迁移，包括REACH法规所列物质，从而为估计这些物质的经皮暴露提供数据基础。该方法涉及无提取样品制备，克服了低分析物回收率问题。在线盐去除至关重要，因为盐和基质成分会强烈影响信号强度和峰形。与以往方法相比，该方法更灵敏，覆盖更广的分析物谱，尽管75种目标PAAs中有5种因保留或信号强度不足被排除。可直接从纺织品释放的PAAs与经连二亚硫酸钠还原迁移偶氮染料形成的PAAs可区分。此外，在还原条件下易降解的含硝基和/或偶氮基团的PAAs也可测定。色谱经优化用于分离结构异构体，从而可区分REACH列出的PAAs（如2-甲基苯胺）与其他同系物（如3-和4-甲基苯胺）。此外，极性PAAs（如2-氨基苯磺酸）获得充分保留，稀释样品无需进一步净化即可直接进样。这避免了有机溶剂的使用和耗时耗力的提取净化步骤，从而节省时间和资源。相比之下，如DIN EN ISO 14362-1中规定的硅藻土净化应避免用于极性PAAs，因为这些分析物回收率差。获得的灵敏度（典型工作范围：0.135–202.5 μg/L，LOQs：0.014–40.5 μg/L）便于在迁移液中定量PAAs，浓度通常至少比欧洲法律限值（每千克纺织品30 mg还原可提取PAA）低100倍。具体来说，90%的分析物的LOQs≤0.405 μg/L（还原方法）和≤4.05 μg/L（非还原方法）。该方法具有良好的平均重复性（3–4%）和操作者无关重现性（4%）。为展示方法的适用性，研究了83个市场纺织品样品中偶氮染料和相关PAAs的迁移。仅在部分样品中检测到痕量REACH列出的PAAs，浓度约0.01–0.059 μg/dm²（0.006–0.037 mg/kg）。然而，其他PAAs如5-氨基-2-氯甲苯-4-磺酸和2-氨基苯磺酸迁移量分别高达2.74 μg/dm²（1.1 mg/kg）和50.3 μg/dm²（21.3 mg/kg）。4-硝基苯胺是最常检测到的非列表PAA（18%的样品，<0.2 μg/dm²）。为将迁移量置于背景中，测定了选定纺织品的还原可提取PAA含量。REACH列出PAA的最高观测含量为2.1 mg/kg（4-氯苯胺），明显低于30 mg/kg的监管限值。非列表PAA 2-氨基苯磺酸含量高达971 mg/kg，在从纤维结合染料裂解的PAAs预期范围内。总体而言，对于还原可提取含量高的PAAs，相对迁移量相当低，反之亦然，导致迁移分数变化范围为<0.1–56%。值得注意的是，许多情况下尽管溶液PAA浓度较低（<0.6 μg/L），纺织迁移液仍观察到明显着色，即使分析前包括还原步骤。这表明存在可裂解亚结构超出本研究70种PAAs范围的偶氮染料迁移。推测染色过程中活性染料的化学修饰使得这些裂解产物无法通过本靶向方法检测。未来工作将致力于通过染料迁移的直接定量和非靶向筛选来检测从纺织品释放的修饰PAAs。”