《Journal of Chromatography B》：Dual high-resolution profiling integrates α-glucosidase inhibition and DPPH assays to identify bioactive constituents in Lygodium japonicum roots
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石奇文|向海平|范颖|吴春燕|童胜强•• 采用双高分辨率分析技术结合α-葡萄糖苷酶检测和DPPH自由基清除实验。•• 从日本石松的根中鉴定出了12种生物活性成分。•• 分离出两种新化合物并确定了其结构。•• 通过多种技术研究分析了这些化合物与α-葡萄糖苷酶的相互作用。引言糖尿病是
石奇文|向海平|范颖|吴春燕|童胜强
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• 采用双高分辨率分析技术结合α-葡萄糖苷酶检测和DPPH自由基清除实验。
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• 从日本石松的根中鉴定出了12种生物活性成分。
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• 分离出两种新化合物并确定了其结构。
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• 通过多种技术研究分析了这些化合物与α-葡萄糖苷酶的相互作用。
引言
糖尿病是一种慢性代谢性疾病，其特征是由于胰岛素分泌不足或胰岛素作用受损而导致持续的高血糖状态[1]。在糖尿病的两种主要类型中，2型糖尿病更为常见。目前，2型糖尿病需要长期管理，主要通过生活方式干预以及旨在控制血糖水平的药物治疗。α-葡萄糖苷酶是参与葡萄糖代谢的关键酶，也是治疗2型糖尿病的重要靶点。包括阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖在内的多种α-葡萄糖苷酶抑制剂被广泛用于延缓碳水化合物的消化，从而减少2型糖尿病患者的餐后血糖波动。然而，这些药物常常会引起胃肠道不良反应，如腹胀、排气增多、腹痛和腹泻，从而导致患者依从性差，并可能引发药物相互作用[2]。这些局限性促使人们寻找新的α-葡萄糖苷酶抑制剂，尤其是来自天然产物中的抑制剂，因为其中一些天然产物可能还具有抗氧化作用[3]。
我们的团队一直在研究具有潜在糖尿病治疗作用的天然产物，此前我们已经报道过，从多种传统中药中提取的黄酮类、萜类和酚类化合物具有很强的α-葡萄糖苷酶抑制作用或抗氧化作用[4]、[5]、[6]。日本石松是一种著名的传统中药，其根、根茎、成熟孢子及地上部分常被用于中药制剂中。传统上，它被用来清热解毒、消除湿气与肿胀[7]。在民间医学中，其根和根茎常被泡茶饮用，用于预防和治疗糖尿病。不过，其活性成分及其作用机制至今仍不甚清楚。
本研究旨在探讨日本石松的根中是否含有具有α-葡萄糖苷酶抑制作用和抗氧化活性的化合物，并分析所分离鉴定出的化合物的生物活性及分子机制。我们采用了基于微孔板的高分辨率生物测定技术来辅助识别生物活性成分[8]。此外，还开发了一种双高分辨率生物活性分析方法，以便准确识别粗提物中的α-葡萄糖苷酶抑制剂和抗氧化剂。对于具有活性的组分，进一步通过二维核磁共振、高分辨率质谱和圆二色光谱技术对其进行了分离和结构鉴定。为了进一步研究这些生物活性化合物与α-葡萄糖苷酶之间的分子相互作用机制，还开展了酶抑制动力学研究、荧光光谱分析以及分子对接分析。
章节要点
化学品与仪器
提取和硅胶柱层析使用了分析级溶剂，而HPLC分离则采用了色谱级溶剂（中国上海Titan Scientific公司产品）。α-葡萄糖苷酶（来自酿酒酵母，活性≥50?U/mg）、对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPG）和DPPH均购自中国上海源恩生物科技有限公司。阿卡波糖和维生素C则从中国上海阿拉丁化学有限公司购买。
用于分离的仪器有
α-葡萄糖苷酶抑制作用与DPPH自由基清除活性的双高分辨率分析
日本石松根提取物的α-葡萄糖苷酶抑制作用和DPPH自由基清除活性数据总结见附表S1。在所有提取物中，二氯甲烷组分表现出最强的α-葡萄糖苷酶抑制活性（IC50为2.94?±?0.05?μg/mL），同时也具有较强的DPPH自由基清除活性（IC50为25.5?±?3.34?μg/mL）。因此，选择二氯甲烷组分进行α-葡萄糖苷酶抑制作用和DPPH自由基清除活性的双高分辨率分析。
结论
通过针对α-葡萄糖苷酶抑制作用和DPPH自由基清除活性开展的双高分辨率分析，从日本石松的根中分离并鉴定了12种化合物，其中包括两种新化合物。化合物7、8和10具有可测量的α-葡萄糖苷酶抑制活性，因此被选为进一步研究其作用机制的候选对象；而化合物1、2、4、5/6和10则表现出中度到强的DPPH自由基清除活性，这说明
作者贡献说明
石奇文：撰写原始稿件、实验研究、资金申请、数据分析。 向海平：实验研究。 范颖：实验研究。 吴春燕：实验研究、资金申请。 童胜强：撰写审稿与编辑稿件、项目监督、资金申请。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了以下机构的资助：中国国家自然科学基金（项目编号22478347、21978266）、浙江省“先锋”和“领雁”研发计划（项目编号2025C04034）、浙江省自然科学基金（项目编号LBY22H280004、LTGD24C080001）、浙江工业大学科学技术研究院（项目编号KYY-HX-20240629、KYY-HX-20210732、KYY-HX-20210066、KYY-HX-20200221、KYY-HX-20190182），以及台州市科学技术局项目（项目编号24nya17）。
