《Journal of Chromatography B》：Optimization of sample preparation for post-translational modification analysis: establishing an accurate method for the determination of deamidation and succinimide intermediates in monoclonal antibodies
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谭成英|段颖|张志林|陈悦|秦国红|徐丹•在4℃低温下使用Lys-C进行消化，能有效减少人工脱酰胺现象。•实验设计表明，在25℃和37℃条件下，pH值与温度之间存在相互作用，难以同时实现最优条件。•仅调整pH值无法同时有效降低脱酰胺和琥珀酰亚胺的形成。•采用快速胰蛋白酶消化法（5
谭成英|段颖|张志林|陈悦|秦国红|徐丹
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在4℃低温下使用Lys-C进行消化，能有效减少人工脱酰胺现象。
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实验设计表明，在25℃和37℃条件下，pH值与温度之间存在相互作用，难以同时实现最优条件。
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仅调整pH值无法同时有效降低脱酰胺和琥珀酰亚胺的形成。
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采用快速胰蛋白酶消化法（5分钟），可使修饰程度降至3.7%，而传统20小时消化法则为26.8%。
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所开发的分析流程提升了治疗用单克隆抗体的LC–MS肽图分析精度。
引言
单克隆抗体是广泛应用于癌症及自身免疫性疾病治疗的重要的生物制剂[1]。为确保其在整个生命周期内的安全性、有效性及一致性，生物制药行业采用了多属性方法。该方法基于高分辨率LC-MS肽图分析，能够在同一平台上同时监测糖基化、氧化和脱酰胺等多种关键质量属性，从而替代传统的正交色谱和电泳检测方法[2]。2025年8月发布的USP第<1060>章进一步推动了该方法的监管认可，为验证、系统适用性以及良好生产规范的实施提供了标准化指南[3]。
在抗体药物的制备、纯化及储存过程中，会经历多种翻译后修饰。其中脱酰胺是最常见且最关键的降解途径之一，它会显著影响抗体的抗原结合亲和力、药代动力学特性、稳定性以及治疗效果[4]、[5]。这种修饰主要发生在天冬酰胺残基上，其次为谷氨酰胺残基。在中性至弱碱性条件下，天冬酰胺通过其侧链羰基与主链氮原子发生亲核攻击，形成环状五元结构的琥珀酰亚胺中间体，随后经过水解作用生成天冬氨酸和异天冬氨酸，通常以异天冬氨酸为主[6]。在酸性条件下，脱酰胺则直接通过酸催化的水解反应发生，无需经过琥珀酰亚胺中间体。准确测定脱酰胺及琥珀酰亚胺中间体的含量对于评估抗体质量和稳定性以及满足相关质量属性监测的监管要求至关重要[7]。
肽图分析结合LC-MS是分析翻译后修饰的标准方法，也是多属性方法分析流程中的核心分析技术[7]、[8]。然而，传统的过夜胰蛋白酶消化方法在监测脱酰胺和琥珀酰亚胺中间体方面存在诸多局限性。胰蛋白酶的最佳作用条件（37℃，pH 8.0）恰好与促进琥珀酰亚胺形成及脱酰胺反应的条件一致[9]、[10]。虽然降低温度和pH值可以减少这些副反应，但胰蛋白酶在酸性（pH＜6.0）或低温（4℃）条件下的活性极低，会导致消化不完全、大量切割位点未被识别以及序列覆盖度较低。这种矛盾会在样品制备过程中引入大量人工修饰，干扰精确的翻译后修饰定量分析，成为实现多属性方法合规及满足监管要求的重大障碍。
尽管已经有一些缓解策略被提出，但大多数策略主要侧重于抑制脱酰胺反应，而同时控制脱酰胺和琥珀酰亚胺中间体的方法仍鲜有研究[11]、[12]。在pH 4.0–4.5条件下使用的酸性蛋白酶（如Glu-C和P13ase）虽能几乎完全避免人工脱酰胺现象，但其切割特异性较低，切割位点遗漏率较高，且对疏水区域的消化也不完全，从而导致肽图分析结果复杂化。重水化学标记法虽可区分体内与体外条件下的脱酰胺现象，但由于试剂成本高昂且数据处理复杂，不适用于高通量多属性方法分析及常规质量控制。对于那些本身就存在琥珀酰亚胺中间体的治疗用蛋白，目前还没有无需引入额外干扰因素就能实现精准定量的成熟方法。低温下使用Lys-C进行消化（4℃）是一种颇具前景的替代方案，因为它既能保持琥珀酰亚胺的稳定性，又能抑制人工脱酰胺现象，同时不会影响切割特异性[13]。不过，针对不同单克隆抗体序列，如何全面优化Lys-C消化效率、人工脱酰胺程度以及琥珀酰亚胺稳定性之间的平衡关系，目前仍有待深入研究。
在本研究中，我们采用了系统实验设计方法，探讨了酶的种类、消化温度、缓冲液pH值以及消化时间等因素对治疗用单克隆抗体中人工脱酰胺现象及琥珀酰亚胺形成的影响。我们找到了一种高效的低温Lys-C消化方案（4℃，pH 7.0，1小时），该方案能使整体人工修饰程度保持在4%以下，并实现较高的序列覆盖度。统计分析表明，在较高温度条件下，琥珀酰亚胺与脱酰胺现象存在相互排斥的关系，这也解释了为何仅调整缓冲液pH值无法同时降低这两种物质的生成量。此外，我们还验证了一种快速的胰蛋白酶消化方案（37℃，5分钟），该方案可将人工修饰程度降至3.7%（而传统20小时消化法的修饰程度为26.8%），同时不影响肽图分析的质量。这两种消化方案都在两种具有不同序列特征的单克隆抗体（IgG1和IgG4）上得到了成功验证，为减少样品制备过程中的干扰、提高基于LC-MS的多属性方法分析精度以及满足生物制药领域的监管要求提供了可靠的、以数据为依据的分析框架。
章节要点
材料与试剂
本研究使用的单克隆抗体样本为：mAb A，属于IgG1类型，浓度为180毫克/毫升；mAb B，属于IgG4类型，浓度为150毫克/毫升，均由本实验室提供。Lys-C（质谱级，产品编号V1671）和胰蛋白酶（测序级，产品编号V5113）购自Promega公司。不同pH值（5.5、7.0和8.0）的盐酸胍和Tris-HCl缓冲液则从Solarbio公司购买。二硫苏糖醇和碘乙酰胺由Sigma-Aldrich公司提供。Zeba?旋转脱盐柱的分子量截留值为7K，容量为0.5毫升，产品编号为89882。
肽图分析质量与消化效率
在系统实验设计实验中，无论是在4℃条件下，还是在25℃且缓冲液pH值为5.5和7.0的条件下，胰蛋白酶都无法产生高质量的消化产物，肽图分析的覆盖度均低于90%。这一结果与已知规律相符，即胰蛋白酶在较低温度下的活性会显著下降，且需要弱碱性环境才能正常工作，因此我们没有对这部分数据展开详细分析。而在37℃条件下，所有样本的肽图分析覆盖度均高于
Lys-C消化对MS检测灵敏度及检测能力的影响
选择合适的蛋白酶对于样品制备及后续的LC-MS分析都至关重要。为确认使用Lys-C和胰蛋白酶得到的分析结果具有可比性，且不受肽链长度的影响，我们对比了这两种酶所产生的相同肽序列。这种方法能够确保准确测定脱酰胺和琥珀酰亚胺修饰的程度，同时消除因肽链长度差异导致的离子化效率差异。当Lys-C用于消化时
结论
在4℃条件下使用Lys-C消化1小时，可以有效抑制人工脱酰胺现象，同时减少琥珀酰亚胺中间体及脱酰胺产物的错误阳性检测。这些效果与脱酰胺反应的动力学规律一致，即反应速率会随温度的升高而呈指数级增长（遵循阿伦尼乌斯方程），并且会受到pH值的显著影响[22]、[23]。在碱性条件下，氢氧根离子会加速脱酰胺反应，而在酸性/中性条件下，该反应的进程则有所不同
CRediT作者贡献说明
谭成英：负责撰写初稿。 段颖：负责撰写初稿。 张志林：负责数据整理工作。 陈悦：负责项目管理工作。 秦国红：负责项目管理工作。 徐丹：负责资源协调工作。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
