高通量声学FFPE蛋白质组学揭示肢端黑色素瘤中ATP5IF1相关的线粒体改变

《Molecular & Cellular Proteomics》：High-throughput acoustic FFPE proteomics reveals ATP5IF1-associated mitochondrial alterations in acral melanoma

　　

福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）档案是皮肤病理学和转化肿瘤学的基础，支持具有临床注释的黑色素瘤队列，但队列规模的蛋白质组学仍然受到上游处理中劳动强度和变异性的限制。研究人员建立了一个板式、声学FFPE蛋白质组学工作流程，并将其与人工智能辅助数字病理学整合，以支持从常规切片中进行成分感知的分子分析。优化后的流程减少了处理步骤，旨在提高重现性，并支持96孔格式的快速并行处理。对40例原发性黑色素瘤（包括肢端雀斑样痣型、恶性雀斑型、浅表扩散型和结节型亚型）进行深度数据非依赖采集（DIA）质谱分析，定量了超过8200个蛋白组，每肿瘤平均5200个蛋白。蛋白质组谱解析了黑色素瘤亚型，并定义了一个肢端雀斑样痣型黑色素瘤程序，该程序富集翻译/生物发生和细胞外基质/粘附过程，同时相对缺乏脂质和脂肪酸代谢及过氧化物酶体通路。监督特征选择突出了TNC、POSTN、EIF4A1和ARF4，并揭示了在肢端雀斑样痣型黑色素瘤中ATP5IF1（一种线粒体ATP合酶调节因子）的选择性缺失。ATP5IF1缺失在调整线粒体代理指标和QuPath衍生的肿瘤含量后仍然存在，并且与相对于复合体V的更高糖酵解相一致。这种病理整合的高通量FFPE蛋白质组学框架支持可扩展的回顾性发现，并提示在代表性不足的黑色素瘤亚型中，与线粒体重塑一致的亚型特异性代谢改变。

**论文解读：高通量声学FFPE蛋白质组学揭示肢端黑色素瘤中ATP5IF1相关的线粒体改变**

**研究背景与问题**
福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织是现代组织病理学和转化肿瘤学的基石，因其可在室温下长期保存组织形态，为基于临床结局和协变量的回顾性蛋白质组学分析提供了独特资源。然而，实现队列规模的蛋白质组学分析仍受限于上游处理（如脱蜡、交联逆转、组织均质化）的标准化不足和劳动强度大。传统多步溶剂脱蜡方法耗时且易引入变异，限制了大规模回顾性研究的可行性。黑色素瘤作为一组解剖学和病因学上异质性的疾病，尤其适合评估可扩展的FFPE蛋白质组学方法。其中，肢端雀斑样痣型黑色素瘤（ALM）发生在手掌、足底和甲床等无毛皮肤区域，在全球人群中相对常见，但常被UV驱动型黑色素瘤数据集所遗漏，且与诊断延迟和预后差异相关。因此，亟需建立一种可扩展、可重复的FFPE蛋白质组学工作流程，以解析亚型特异性分子特征，尤其关注ALM这一代表性不足的亚型。

**研究内容与结论**
研究人员开发并验证了一个板式、声学FFPE蛋白质组学工作流程，整合了人工智能辅助数字病理学，从常规石蜡切片中实现成分感知的分子分析。该流程包括一步脱蜡、短时高温交联逆转、96孔自适应聚焦声学（AFA）均质化、乙醇沉淀和S-Trap（Suspension trapping）消化，显著减少了手动操作时间，并支持96孔格式的快速并行处理。将该工作流程应用于来自墨西哥国家癌症研究所（INCAN）的40例原发性黑色素瘤FFPE样本（4种亚型：肢端雀斑样痣型、恶性雀斑型、浅表扩散型和结节型，各10例），通过数据非依赖采集（DIA）质谱分析，共定量超过8200个蛋白组，每肿瘤平均5200个蛋白。蛋白质组谱成功解析了黑色素瘤亚型，并定义了ALM特有的程序，该程序富集翻译/生物发生和细胞外基质（ECM）/粘附过程，同时相对缺乏脂质和脂肪酸代谢及过氧化物酶体通路。监督特征选择（随机森林、LASSO回归和feseR）突出了TNC、POSTN、EIF4A1和ARF4等亚型区分蛋白，并发现ATP5IF1（ATP合酶抑制因子1）在ALM中显著选择性缺失。进一步分析表明，ATP5IF1缺失独立于线粒体含量（以VDAC1/VDAC2为代理）、复合体V丰度、线粒体动力学代理指标以及QuPath衍生的肿瘤含量，且ALM中糖酵解模块相对于复合体V的比值更高。该研究证实了ALM作为生物学上独特的黑色素瘤实体，并提出了亚型特异性线粒体改变的新假说。论文发表在《Molecular》。

**主要技术方法**
研究人员采用优化的板式FFPE蛋白质组学流程，核心步骤包括：使用EnVision缓冲液进行一步脱蜡和热诱导交联逆转（99°C，10分钟），随后在Covaris R230声波仪上进行96孔AFA均质化（5分钟/列，功率350 W，占空比30%），再经高温（99°C，1小时）增强裂解和交联逆转，第二次AFA均质化后，通过S-Trap 96孔板进行酶切和肽段纯化。肽段以DIA模式在Q Exactive HF-X Orbitrap质谱仪上分析，数据经DIA-NN v2.2处理，以1%假发现率（FDR）进行蛋白鉴定和定量。数字病理方面，相邻H&E切片经QuPath分析，定量肿瘤成分、细胞外基质（ECM）和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）富集区域，用于下游统计校正。样本队列来源于墨西哥国家癌症研究所（INCAN），共40例FFPE原发性黑色素瘤，涵盖4种亚型。

**研究结果**
- **Optimization of a High-Throughput FFPE Extraction Method**：通过系统比较不同脱蜡策略、裂解缓冲液和声学处理参数，确定一步EnVision脱蜡结合SDS裂解缓冲液和5分钟AFA均质化为最佳方案，相比传统多步协议和制造商推荐流程，肽段产量和蛋白鉴定数分别提高约1.5倍和35%，且技术重现性更优。96样本处理时间从传统协议的>30小时缩短至约3小时。
- **Histopathological Characterization of Melanoma Samples**：两名病理学家独立确认亚型，QuPath分析显示不同亚型间肿瘤含量、ECM和TIL区域无显著差异（Kruskal-Wallis检验p>0.05），多变量PERMANOVA也未发现整体组织组成差异，表明下游蛋白质组差异主要由生物学而非组成差异驱动。
- **Proteomic Profiling of Melanoma FFPE Cohort**：DIA分析共定量8219个蛋白组，每肿瘤平均5200个蛋白。无监督聚类（UMAP和层次聚类）显示肿瘤分离与亚型基本一致。基因集富集分析（GSEA）比较ALM与非肢端黑色素瘤，发现ALM中正富集翻译延伸/起始、ECM组织、胶原形成和整合素信号通路，负富集脂质和脂肪酸代谢、过氧化物酶体蛋白输入及染色质修饰通路。监督特征选择（随机森林、LASSO、feseR）识别的差异蛋白集合（如TNC、POSTN、EIF4A1、ARF4）进一步聚类出亚型特异的蛋白质组状态，并关联临床病理变量（如Breslow厚度、溃疡状态）。
- **Stoichiometric depletion of ATP5IF1 distinguishes acral melanoma**：ATP5IF1在ALM中显著低于其他亚型（one-way ANOVA，Dunnett多重比较检验）。线性模型校正线粒体负荷（VDAC复合评分）、复合体V丰度、线粒体动力学评分和QuPath肿瘤含量后，ATP5IF1的ALM缺失效应仍显著。ATP5IF1与代理蛋白相关性弱，且ALM中糖酵解模块相对于复合体V的比值（Glyco_per_ComplexV）显著高于其他亚型，提示ALM中ATP合酶调控改变和能量代谢向糖酵解偏移。

**总结与讨论**
研究人员建立了一个可扩展、病理整合的FFPE蛋白质组学工作流程，解决了队列规模分析中上游处理可重复性和吞吐量的瓶颈，并成功应用于黑色素瘤亚型解析。该工作流程的实用优势在于：简化操作、支持96孔并行处理、深度蛋白质组覆盖（>8200蛋白组），以及通过数字病理整合实现成分感知的分子解释。在ALM中，研究人员发现ATP5IF1的选择性缺失，且独立于肿瘤含量、线粒体负荷、复合体V丰度和动力学代理，伴随糖酵解相对增强。这一结果不支持简单的“线粒体减少”解释，而提示更特异的ATP合酶调控改变。机制上，ATP5IF1（即IF1）是pH敏感的F1Fo-ATP合酶抑制剂，限制反向ATP水解活性。降低IF1比率可能允许线粒体在呼吸受限时通过消耗糖酵解ATP维持膜电位（Δψm），支持线粒体蛋白输入和代谢交换，但这同时增加对糖酵解ATP供应的依赖。该假说可通过耗氧率、Δψm稳定性、寡霉素敏感性等实验验证。研究结论可翻译为：总之，研究人员建立了一个可扩展的、病理整合的FFPE蛋白质组学工作流程，该流程解析了黑色素瘤亚型相关的蛋白质组状态，并将ALM识别为一个独特的通路和特征水平状态。在该状态下，ATP5IF1的缺失（独立于肿瘤含量、线粒体负荷、复合体V丰度和动力学代理）以及糖酵解相对于复合体V的增加，为ALM特异性线粒体改变（与线粒体重塑一致）提供了一个新的、可检验的假说。