体外检测人类及大鼠神经元中的致癫痫化合物：多实验室、多模型评估

《NeuroToxicology》：Detection of seizurogenic compounds in human and rat neurons in vitro: a multi-laboratory, multi-model assessment

　　露丝·罗伯茨|克塞尼娅·布利诺娃|科比·卡尔森|马修·卡托|凯瑟琳·奇什|TK·菲斯特|韩晓波|石桥悠人|神田康成|穆罕默德·克里尔|保罗·莱维斯克|宫本纪正|詹妮弗·B·皮尔森|蒂莫西·J·谢弗|斯科特·沙赫特尔|克里斯·斯特洛克|吉永隆|铃木伊仓•在鼠类和人类iPSC衍生的神经培养物中检测MEA是一种有用的筛选工具，可用于评估癫痫发作潜力•测试化合物在三大洲的7个不同实验室的MEA上进行了评估。•在各个研究地点的鼠类和人类iPSC模型中都观察到了癫痫发作表型•尽管实验方案存在差异，但人类iPSC模型在不同地点的表现更为一致•应根据研究目的在每个测试地点明确并描述所选模型。引言中枢神经系统（CNS）毒性导致了药物发现和开发过程中25%的失败，依然是药物研发失败的主要原因。在临床开发阶段，它也是与安全性相关的失败中最常见的原因之一，这一阶段的资源投入和患者影响都更大（Cook等人，2014年；Morgan等人，2018年）。在CNS相关不良反应中，癫痫发作和震颤尤为常见，分别占非临床研究报告中观察结果的67%和65%（Authier等人，2016年；Orciani等人，2024年）。值得注意的是，日本有一些已获批的药物，在临床使用中出现了癫痫/惊厥现象，但在临床前研究中并未被认定为具有致癫痫性（Nagayama，2015年）。与癫痫发作风险相关的化合物涵盖多种药理类别，包括心血管药物、胃肠道药物、呼吸系统药物、抗炎药物，以及专门针对CNS的药物（Aagaard和Hansen，2013年；Easter等人，2009年；Nagayama，2015年；Walker等人，2018年）。那些旨在穿透血脑屏障以到达目标部位的化合物，其不良反应可能更为普遍（Aagaard & Hansen，2013年）。除了药物之外，接触某些类别的环境化学物质也会引发癫痫发作，这些化学物质包括有机磷神经毒剂如沙林（Pessah等人，2016年；Williamson等人，2019年）、爆炸物成分如RDX（Brown等人，2023年；Fang等人，2023年）、除草剂如草甘膦（Calas等人，2016年；Park等人，2018年），以及有机氯杀虫剂如狄氏剂（Costa，2015年）。因此，了解环境化学物质的潜在癫痫发作风险对于保障职业安全和人类健康非常重要。国际人用药品技术要求协调委员会（ICH）制定了安全指南（S7A），旨在保护人体临床试验受试者和患者。ICH S7A仅提供了关于CNS安全药理学的一般指导，并未指定具体的体外检测方法。目前，癫痫发作的检测依赖于旨在支持临床开发的体内非临床研究中的观察结果（Easter等人，2009年；Nagayama，2015年）。然而，这些后期评估对早期化合物的设计和优化作用有限。CNS副作用，如震颤或其他异常运动，通常需要通过后续的脑电图（EEG）检查来确认。此外，在较低剂量下，化合物可能会引发局灶性癫痫发作，而这些发作不会发展成可见的惊厥，从而延迟了对有害CNS化合物不良反应的检测和预防。同样，历史上化学物质的监管也严重依赖动物研究来识别神经毒性危害（Jett，2012年）。目前ICH S7A的修订工作强调了需要更具预测性的CNS安全评估方法。因此，人们需要成本更低的方法，以便在药物开发过程的更早阶段检测癫痫发作风险，或用于更快地识别毒性危害。近年来，利用多电极阵列（MEA）培养的神经细胞进行连续、无创地测量与神经元动作电位相关的自发电脉冲及脉冲群（爆发）的技术取得了进展（Nam & Wheeler，2011年）。这些活动模式表现出同步性和振荡行为，这与突触形成、神经网络发育有关，反映了兴奋性突触和抑制性突触之间的平衡（Chiappalone等人，2006年；Maeda等人，1995年；Muramoto等人，1993年）。在MEA上已经使用原代啮齿动物和人类iPSC衍生的神经细胞培养物一致地展示了此类活动。MEA上测量的神经网络活动可以通过具有多种作用机制的化合物来调节（Cohen等人，2025年；Johnstone等人，2010年；Tukker等人，2018年），包括电压门控钠通道调节剂、电压门控钾通道调节剂以及GABA受体拮抗剂，这些化合物通常被纳入用于筛选抗癫痫药物和致癫痫药物的检测组中（Bradley等人，2018年；Fan等人，2019年；Grainger等人，2018年；Kreir等人，2018年）。最近的研究表明，将MEA衍生的自发活动谱与人离子通道检测数据相结合，可以成功预测药物发现项目中的癫痫发作风险（Rockley等人，2023年）。美国食品药品监督管理局药物评价和研究中心（CDER）将这种方法视为一种有前景的新安全评估方法学（NAM）（Avila等人，2023年）。这些进展凸显了MEA平台在体外早期检测致癫痫风险方面的潜力。然而，要更广泛地应用这一技术，就需要对所需的方法、细胞模型和分析参数进行协同评估，以便为更大规模的非临床化合物癫痫发作风险筛查标准化MEA检测方法。为满足这一需求，我们进行了多实验室、多模型的评估，使用鼠类原代神经元和人类iPSC衍生的神经培养物来检测癫痫发作。我们的目标是描述MEA的基线活动情况，评估化合物在不同模型中引起的变化，以及确定各测试地点之间可重复的特征和参数。加强这些方法的应用，可以显著提高神经元毒性筛查的效率，减少后期开发失败，并通过减少对动物实验的依赖，支持“3R”原则（减少、优化、替代）。片段内容化合物本研究使用的化合物测试组包含10种不同的小分子，其中包括3种阴性对照（见表1）。所有化合物均从Cayman Chemical或Sigma-Aldrich购买。这些化合物是根据先前的癫痫发作风险研究（Easter等人，2009年以及HESI神经毒性MEA小组的先前工作（Roberts等人，2021年））挑选的。储备溶液溶解在DMSO中，储存在-20°C下直至使用。测试浓度是根据报道的人类毒性暴露剂量确定的。人类iPSC衍生的神经元和星形胶质细胞包括BMS、东北工业大学、FUJIFILM CDI、Cyprotex、EPA（Herr，2026年）、FDA以及NeuCyte在内的7个不同实验室，它们使用了市售的人类iPSC衍生的神经元，这些神经元由谷氨酸能神经元和GABA能神经元混合组成。这些细胞通常与人类iPSC衍生的星形胶质细胞或原代人类星形胶质细胞共同培养（见表2a）。不同商业来源的培养方法在接种密度和培养基方面存在差异，具体见表格。MEA记录与数据分析在仪器上平衡60分钟后，获取基线MEA记录（≥15分钟），以此根据各孔中脉冲、网络爆发和同步性的均匀性来评估培养质量。比较了不同实验室之间以及同一实验室内各模型的基线活动情况（见表3）。细胞以5种不同的浓度接触化合物，每种浓度至少设置3次技术重复，培养60分钟后，再次记录MEA活动至少15分钟。数据标准化为确保各测试地点的数据一致性，在参数分析之前进行了数据标准化处理。首先，对于每个孔，计算每个参数的基线值与化合物处理后的值之间的差异。然后使用以下公式计算标准分数：标准分数=（处理后值－基线值）－（DMSO平均值）/（DMSO标准差），其中DMSO平均值是指用DMSO处理的孔的所有差异值的平均数；DMSO标准差是指该平均值的标准差。人类与鼠类神经元活动的比较无论是鼠类（6个实验室）还是人类（7个实验室）的神经元模型，在所有测试地点都显示出强烈的放电、爆发和同步网络活动，DMSO处理下的基线数据也较为相似。两种模型在基线活动模式上存在细微差异（见补充图1），而且使用相同模型的不同实验室之间也存在一定差异（见表3）。总体而言，人类iPSC衍生的神经培养物在不同实验室之间的变异度更低。讨论在这里，我们展示了一项多中心、多模型的评估结果，旨在评价MEA平台检测癫痫发作风险的能力。我们描述了每种细胞-平台组合在不同孔、不同培养板以及不同地点的神经网络表型，量化了脉冲、爆发和同步性，以及描述这些特征的变异参数。重要的是，我们同时评估了人类神经元和鼠类神经元，因为这两种仍然是最常用的模型。总体而言，所有参与的中心都……CRediT作者贡献声明吉永隆：方法学、研究、数据整理。TK·菲斯特：方法学、研究、数据整理。克里斯·斯特洛克：写作——审稿与编辑、写作——初稿、方法学、研究、正式分析、数据整理、概念构建。凯瑟琳·奇什：方法学、研究、数据整理。石桥悠人：可视化、方法学、研究、正式分析、数据整理。铃木伊仓：写作——审稿与编辑、可视化、方法学、研究、利益冲突声明作者声明存在以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：神田康成表示获得了日本厚生劳动省的财政支持。神田康成还表示获得了日本医学研究开发机构的财政支持。露丝·罗伯茨表示与ApconiX存在雇佣关系。科比·卡尔森、凯瑟琳·奇什、斯科特·沙赫特尔表示……致谢/利益冲突/免责声明文中提及的商标或商业产品并不构成对其使用的推荐。本文表达的观点仅为作者个人观点，不一定代表美国环保局的立场。本研究部分得到了日本厚生劳动省（25KD2001项目，资助对象为Y.K.）和日本医学研究开发机构（AMED）（JP25mk0121309项目，资助对象为Y.K.和I.S.；JP233fa727001项目，资助对象为Y.K.；25be1004103h0001项目，资助对象为I.S.）的研究经费支持。R.R.是……