《Frontiers in Immunology》：Exploring macrophage polarization: biological insights, key laboratory techniques and research perspectives
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巨噬细胞是先天免疫系统的核心效应细胞，构成抵御病原体入侵的第一道防线，同时维持组织稳态。作为高度特化的吞噬细胞，其通过清除病原体、凋亡及异常细胞，协调固有与适应性免疫应答。稳态条件下，巨噬细胞处于静息但持续监视的状态，通过感知微环境动态维持组织完整性，且不诱发
巨噬细胞是先天免疫系统的核心效应细胞，构成抵御病原体入侵的第一道防线，同时维持组织稳态。作为高度特化的吞噬细胞，其通过清除病原体、凋亡及异常细胞，协调固有与适应性免疫应答。稳态条件下，巨噬细胞处于静息但持续监视的状态，通过感知微环境动态维持组织完整性，且不诱发不必要的炎症反应。组织驻留巨噬细胞（如脑内小胶质细胞、肝内库普弗细胞）受局部微环境信号塑造呈现功能特化，可适配器官特异性生理需求。近年来，学界对巨噬细胞表型多样性与可塑性背后的分子及信号机制认知显著提升，但其生物学行为仍高度复杂：一方面，巨噬细胞对时空异质性的微环境信号产生动态响应，促炎与抗炎状态常共存；另一方面，实验层面仍存在分离流程变异、重叠活化状态区分困难、通用可靠表型标志物缺失、功能随环境依赖性波动等挑战。此外，体外培养体系、动物模型差异及高维分析技术局限导致数据解读困难，跨研究可比性降低。因此，开发并实施标准化的优化实验方案——涵盖细胞分离、培养条件、刺激策略、多参数表型分析及互补性功能检测——对提升研究可重复性与转化相关性至关重要。本综述系统梳理巨噬细胞生物学与表型可塑性的现有认知，聚焦核心调控机制、实验局限性与方法学考量。通过严谨标准化策略深化对巨噬细胞行为的理解，将为自身免疫病、感染性疾病、肿瘤及其他慢性炎症性疾病的靶向治疗研发提供有力支撑。
1 巨噬细胞及其在免疫系统中的作用
先天免疫应答是机体的首道防御屏障，依托物理化学屏障及快速非特异性的细胞活性抵御病原体入侵。巨噬细胞作为特化吞噬细胞是这一过程的执行核心，属于髓系谱系，起源于造血系统，可分化为单核细胞、粒细胞及部分树突状细胞亚群。其来源包括胚胎期定植组织的自我更新驻留群体，以及炎症期招募的循环单核细胞。巨噬细胞的功能定义超越起源限制，以“大吞噬者”为特征，执行吞噬作用、免疫调节及组织稳态维持。其核心功能包括清除病原体与异常细胞（含肿瘤细胞）、通过清除死亡细胞衔接固有与适应性免疫，同时分泌细胞因子、提呈抗原（程度各异）、调控炎症并促进组织修复。无危险信号时，巨噬细胞维持静息状态，通过吞噬作用与受体介导的感知持续监测环境，随时准备响应感染或组织损伤信号。巨噬细胞广泛分布于肺、肝、脑、皮肤等组织，可依据局部时空信号调整功能：如脑驻留小胶质细胞参与突触精细化修剪，为神经元提供支持，并在损伤后启动精准受限的修复反应以减少继发性损伤；肝驻留库普弗细胞适应肠道来源物质持续暴露的微环境，耐受非致病性微生物抗原，同时清除致病菌、死亡细胞及碎片。此类组织特异性适应导致巨噬细胞基因表达谱与表面受体活性存在差异，但所有巨噬细胞均具备快速响应全身危险信号的潜能。尽管近几十年巨噬细胞表型转换机制研究取得显著进展，但其行为仍因动态表型异质性及微环境信号通路的复杂性而未完全阐明。巨噬细胞生物学的复杂性带来多重研究挑战：异质性促炎/抗炎表型群体区分困难、可靠生物标志物鉴定受限、高维分析技术难以精准解析细胞行为。因此，阐明不同微环境下巨噬细胞表型转换规律，对开发调控其促炎/抗炎特性的创新策略、提升自身免疫病、感染性疾病、肿瘤等疾病的诊疗精准性至关重要。需强调的是，巨噬细胞的功能多样性并非固定分类，其活化状态共存且持续受局部微环境信号重塑。
1.1 巨噬细胞极化与分类概述
巨噬细胞具备显著的功能可塑性，可从静息态向活化态转换，并根据组织微环境调整功能。本综述采用M0、M1、M2框架作为概念支架，同时明确体内巨噬细胞表型远较此分类异质且动态。稳态下，静息态巨噬细胞被称为M0型，执行组织完整性监测、凋亡与衰老细胞清除等稳态过程。损伤或病原体暴露时，巨噬细胞通过模式识别受体（PRR）识别危险信号，提呈外源性抗原，启动并塑造适应性免疫应答。响应局部微环境信号，巨噬细胞沿促炎-抗炎轴呈现多功能表型，该过程被称为“巨噬细胞极化”。当炎症或损伤信号消退，巨噬细胞可恢复至静息M0态以维持组织稳态，这一高度可塑的过程允许巨噬细胞整合复杂环境信号、必要时发生迁移，维持炎症与组织健康的平衡。鉴于活化状态的高度可塑性及共存特性，M1与M2分类仅作为概念参考点而非离散生物学状态，划分依据包括功能表型、分泌的细胞因子及特征性表面标志物。M1样表型为促炎性，抑制细胞增殖并诱导炎症反应，驱动辅助性T细胞1（Th1）型免疫应答对抗细菌等病原体，响应Toll样受体（TLR）激活的炎症信号通路。相反，M2样表型为抗炎性，与哮喘、过敏反应等Th2型应答相关，促进细胞增殖与组织修复。经典的M1/M2极化范式本质是巨噬细胞对细胞因子微环境的响应：Th1来源细胞因子如干扰素-γ（IFN-γ）诱导M0向M1极化，Th2来源细胞因子如白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-13（IL-13）则驱动M2极化。因此，巨噬细胞极化不仅塑造免疫应答类型，其最终表型也反映炎症局部的免疫微环境特征。
1.1.1 M1巨噬细胞表型
促炎性M1巨噬细胞是启动抗病原体免疫应答的核心。其主要由Th1细胞因子（尤其是IFN-γ）及脂多糖（LPS，革兰氏阴性菌外膜特有成分，通过激活TLR4强力诱导促炎表型）激活。M1极化的核心特征包括表面标志物表达：分化簇80、86（CD80、CD86）、主要组织相容性复合体II类（MHC-II）、TLR2、TLR4，以及胞内酶诱导型一氧化氮合酶（iNOS）。同时，M1巨噬细胞分泌大量促炎细胞因子与趋化因子，典型包括IL-6、IL-12、IL-1α、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α），这些因子对启动并维持炎症、有效清除病原体至关重要。活化后的M1巨噬细胞还分泌CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL16、CCL5等趋化因子，支持Th1炎症反应，并增强IFN-γ诱导的iNOS与活性氧（ROS）生成，通过释放抗菌效应分子协助淋巴细胞清除病原体。该促炎因子组合显著提升M1巨噬细胞的细胞毒性与杀菌能力。但需注意，M1巨噬细胞过度或持续活化可导致组织破坏与慢性炎症。此外，循环单核细胞可被招募至炎症部位分化为巨噬细胞，此类浸润性巨噬细胞通常成熟度较低、寿命较短，但对刺激的反应性强于驻留群体。
1.1.2 M2巨噬细胞表型
M2巨噬细胞通常被定义为抗炎表型，其功能远超单纯炎症抑制。其特征性表面标志物包括清道夫受体CD163、C型凝集素受体CD209、甘露糖受体CD206，以及胞内蛋白与酶如FIZZ1、Ym1/2、精氨酸酶1（Arg1）。其中CD206因可识别凋亡细胞糖基化分子及细胞外基质成分，在协助M2巨噬细胞执行组织修复、碎片清除及免疫调节中发挥关键作用，且不引发强烈初始炎症反应。M2巨噬细胞释放IL-10、转化生长因子-β（TGF-β）等抗炎细胞因子，下调炎症进程以促进组织修复，同时分泌IL-4、IL-13等细胞因子促进Th2应答，进一步诱导M2样极化。其分泌的CCL17、CCL18、CCL22、CCL24等趋化因子可招募组织修复所需细胞，而血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）等生长因子则参与血管生成、伤口愈合与组织重塑。此外，M2巨噬细胞通过释放CCL17、CCL22招募Th2细胞，并产生基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9，降解现有细胞外基质（ECM）成分，为新ECM建立及成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞迁移创造条件，推动组织修复与再生。根据转录与功能异质性，M2巨噬细胞可分为M2a、M2b、M2c、M2d亚群：IL-4与IL-13激活的M2a参与组织重塑、伤口愈合及Th2免疫调节；免疫复合物与TLR激动剂激活的M2b兼具促炎与抗炎活性，参与免疫调节；IL-10、TGF-β或糖皮质激素诱导的M2c介导免疫抑制与组织修复；IL-6联合TLR激动剂诱导的M2d则与血管生成及肿瘤进展相关。需警惕的是，M2巨噬细胞也具有致病潜力，可通过营造免疫抑制微环境促进肿瘤发生与转移，为肿瘤研究带来挑战。
1.1.3 人鼠巨噬细胞常见标志物的物种差异
尽管M1/M2极化框架已在小鼠模型中得到充分表征，但许多定义这些状态的经典标志物在物种间并不保守。直接将小鼠巨噬细胞表型外推至人类系统可能产生误导，尤其在转化与临床研究中。最显著的差异体现在精氨酸代谢相关酶的表达：小鼠中iNOS是促炎性M1样巨噬细胞的标志性分子，Arg1则与抗炎M2样巨噬细胞强相关；但在人类巨噬细胞中，iNOS表达通常较低或在同等条件下受严格调控，Arg1并非替代活化的可靠标志物。类似地，小鼠M2标志物Ym1/2、FIZZ1在人类中不存在，进一步凸显物种特异性差异。相比之下，部分表面标志物与细胞因子在物种间更具保守性，但表达模式仍受环境调控：CD206、CD163常用于识别人类抗炎或组织相关巨噬细胞，而在小鼠中其表达水平与功能意义可能存在差异；促炎标志物CD80、CD86及MHC-II（人类对应为HLA-DR）在两物种中均存在，但其调控与共表达谱受组织环境与信号条件影响。值得注意的是，转录组与单细胞分析进展表明，人鼠巨噬细胞活化状态均高度异质，受复杂微环境信号塑造。即使表达相似标志物，其潜在基因调控网络与功能输出也可能存在物种差异。因此，依赖有限经典标志物可能简化巨噬细胞生物学本质，掩盖关键的种间差异。
1.2 M1与M2极化相关的信号通路与生物标志物
巨噬细胞向M1或M2表型的极化受多条复杂信号通路调控，这些分子互作网络是驱动极化的核心。信号通路响应细胞因子、生长因子或微生物组分等外部刺激，在特定生理病理背景下启动基因簇转录与功能执行。M1极化涉及核因子-κB（NF-κB）信号通路激活，上调TNF-α、IL-6、IL-12等促炎细胞因子；IFN-γ刺激则通过Janus激酶-信号转导与转录激活因子1（JAK-STAT1）通路促进M1基因表达。NF-κB通路是M1活化的主调控因子，协调细胞因子、趋化因子及炎症相关酶的生成；干扰素调节因子3（IRF3）、IRF5等转录因子也参与IL-12、IL-23等促炎基因的转录调控。此外，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路（含ERK、JNK、p38 MAPK）可被TLR下游的炎症信号激活，诱导M1应答相关的促炎基因转录。NOD样受体家族pyrin结构域 containing 3（NLRP3）炎症小体可被病原体相关分子模式（PAMP）或损伤相关分子模式（DAMP）激活，切割caspase-1，成熟并释放IL-1β与IL-18，驱动炎症并增强抗菌应答。与之相对，M2表型转换由独特的信号通路簇介导。JAK-STAT通路是M2极化的必需通路，IL-4与IL-13主要通过STAT6与Krüppel样因子4（KLF4）发挥作用，其受体结合后启动组织修复、抗炎功能相关基因转录，上调Arg1等特征标志物。IL-10作为M2极化的重要诱导因子，结合受体后激活JAK1，进而激活STAT3，促进抗炎细胞因子生成并抑制促炎应答。此外，c-MYC、IRF4、NF-κB p50同源二聚体、c-Maf、缺氧诱导因子-2α（HIF-2α）等转录因子调控M2极化，驱动抗炎应答、组织修复及低氧条件下的代谢适应。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）作为核受体，被特定代谢产物激活后可引导巨噬细胞向抗炎代谢模式转变；TGF-β信号通路则通过调控细胞生长与ECM生成促进伤口愈合与纤维化。M2巨噬细胞还通过分泌VEGF等生长因子诱导血管生成，支持组织修复与重塑。
1.3 巨噬细胞表型的异质性、可塑性与再极化动力学
巨噬细胞是高度动态的细胞，具备显著的表型可塑性，可快速适应多样微环境信号。这种可塑性体现为巨噬细胞响应病原体、细胞因子、组织来源因子等刺激时，修饰基因表达程序、信号通路及效应功能的潜能。其功能表型由复杂重叠的环境信号塑造，呈现渐进、可逆且环境依赖性的转换特征。巨噬细胞异质性还受其发育起源与组织特异性微环境影响：组织驻留巨噬细胞可源于胚胎期早期定植的前体细胞，而炎症相关巨噬细胞常由骨髓招募的循环单核细胞分化而来。不同起源导致转录程序、代谢谱、自我更新能力及对外部刺激的响应性存在差异。此外，局部组织来源因子持续塑造巨噬细胞身份，形成适配肝、肺、脑、皮肤及肿瘤微环境等特定器官生理需求的特化群体。因此，不同解剖部位分离的巨噬细胞或不同实验体系（如外周血单核细胞来源巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞）来源的巨噬细胞，可能因内在发育编程与微环境驯化，对同一刺激产生差异化响应。M0、M1、M2分类体系仅为实验与体外研究的概念简化框架，实际上巨噬细胞呈现介于两者之间的中间表型与混合表型，尤其在体内条件下可同时整合多重信号输入。这种转换包括M1向M2、M2向M1的双向偏移，以及向静息M0态的复归，统称为巨噬细胞再极化。这一过程解释了免疫系统如何响应不同刺激实现功能适应：如感染或组织损伤过程中M1向M2的转换，既反映其在炎症进展中的功能角色，也体现其启动调节过程恢复稳态平衡的潜能。失控的炎症或不当的炎症抑制均表明，M1与M2巨噬细胞均具备在病理进程中促进免疫稳态的潜能。越来越多的证据表明，巨噬细胞常同时共表达传统定义的M1与M2标志物：暴露于IFN-γ或TNF-α等促炎信号联合IL-4或IL-13等抗炎信号的巨噬细胞，可呈现兼具两种状态的混合表型。小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）经LPS+IFN-γ、IL-4或两者联合处理后的单细胞RNA测序（scRNA-seq）显示，LPS+IFN-γ激活的基因与IL-4诱导的基因可在同一细胞内共表达，证明对立程序的同时激活。其他共刺激研究也在疾病相关巨噬细胞中观察到炎症与调节性表型标志物的共表达，进一步支持巨噬细胞活化是连续功能谱而非严格分离类别的观点。
2 疾病背景下的巨噬细胞极化
2.1 感染性疾病
感染性疾病中，巨噬细胞极化是决定宿主防御效能的核心因素，既引导免疫应答走向病原体清除，也调控炎症程度与组织损伤程度。研究显示，具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）来源的外膜囊泡含LPS、外膜蛋白等PAMP，可激活TLR介导的信号通路，诱导BMDM从M0向M1表型极化，触发NF-κB等促炎信号级联，上调IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS等M1相关标志物，最终导致具核梭杆菌诱导的牙周炎模型中炎症加剧、牙槽骨吸收及牙周组织破坏。慢性过度活化的M1巨噬细胞分泌的细胞因子与效应分子可导致继发性组织损伤与免疫病理，需及时消退以防止慢性炎症迁延。此时，巨噬细胞必须向M2样状态转换以协助感染清除与组织修复：M2样状态通过分泌IL-10、TGF-β等抗炎细胞因子抑制炎症。因此，巨噬细胞极化不仅决定感染性疾病的进展，也影响最终的愈合结局。巨噬细胞的可塑性及M1/M2状态切换能力，使免疫系统既能清除病原体又能恢复组织稳态，凸显其在感染性疾病严重程度与进展中的核心地位。
2.2 慢性炎症与自身免疫病
实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）、类风湿关节炎（RA）等慢性炎症与自身免疫病均以持续性M1极化为特征。此类疾病中，巨噬细胞（尤其是M1亚群）持续分泌促炎细胞因子，维持局部炎症、组织损伤并招募自身反应性免疫细胞。系统性促炎微环境可加重疾病严重程度并导致免疫失调。例如，小胶质细胞向促炎M1表型极化在EAE发病中起关键作用，通过促进神经炎症与脱髓鞘病变进展，而抗炎M2表型占比不足；黄芪多糖可通过抑制M1极化、促进M2极化恢复小胶质细胞平衡，减轻疾病严重程度，提示靶向小胶质细胞极化是神经炎症性疾病的潜在治疗策略。RA发病机制中，关节部位促炎M1巨噬细胞分泌的细胞因子维持局部炎症、驱动组织损伤并招募自身反应性免疫细胞，加剧病情；叶酸修饰银纳米颗粒可选择性诱导M1巨噬细胞凋亡并促进M2极化，有效减轻RA模型的关节炎症与组织损伤，证实巨噬细胞极化是RA治疗的潜在靶点。另一方面，M2巨噬细胞通常通过分泌IL-10、TGF-β等抗炎细胞因子与生长因子，限制免疫介导的组织损伤并促进关节再生，在RA中发挥炎症消退与组织修复作用。
2.3 肿瘤与肿瘤微环境
肿瘤微环境中的巨噬细胞极化是决定肿瘤进展、免疫逃逸及治疗响应的关键因素。经典活化的M1巨噬细胞发挥促炎与抑瘤功能，通过分泌细胞因子激活细胞毒性免疫细胞并抑制肿瘤生长；而替代活化的M2巨噬细胞（作为肿瘤相关巨噬细胞TAM的主要组成）则通过分泌免疫抑制因子、促进血管生成、重塑细胞外基质及抑制抗肿瘤免疫，支持肿瘤生长。肿瘤干细胞也可主动调控肿瘤微环境中的巨噬细胞极化，维持免疫抑制、促瘤的生态位。TAM表型转换由IL-4、IL-10、TGF-β等肿瘤来源信号驱动，使其脱离正常功能状态。与健康组织巨噬细胞相比，TAM不仅高表达CD206、CD163、Arg1等表面标志物，还持续分泌抗炎细胞因子，并上调VEGF、MMPs的分泌，共同促进肿瘤生长、血管生成与细胞外基质重塑。研究发现，将TAM从促瘤M2表型重编程为抑瘤M1表型可增强抗肿瘤免疫：甘露糖功能化的巨噬细胞膜包被上转换纳米颗粒可选择性靶向缺氧乳腺癌中的M2型TAM，内化后产生活性氧并释放氧气，促进TAM向M1极化；重编程的M1巨噬细胞分泌促炎细胞因子，重塑肿瘤微环境，在体外与体内均抑制肿瘤生长。这些发现表明，TAM极化是癌症免疫治疗的 promising 策略，可通过将免疫抑制性肿瘤生态位转化为促炎抑瘤微环境发挥作用。
2.4 组织修复、纤维化与动脉粥样硬化
巨噬细胞极化在组织修复及纤维化、动脉粥样硬化等慢性疾病进展中发挥重要作用。循环单核细胞被招募至组织损伤或炎症部位，响应局部微环境信号浸润并分化为巨噬细胞。组织损伤恢复期，巨噬细胞经历从M1向M2表型的转换，分泌VEGF、TGF-β等多种生长因子，促进血管生成、细胞外基质重塑与组织修复，这对损伤或炎症后恢复组织完整性与稳态至关重要。在动脉粥样硬化中，巨噬细胞极化决定斑块的形成与稳定性：早期病变中以M1巨噬细胞为主，其分泌的促炎细胞因子、ROS及基质降解酶导致内皮功能障碍与斑块不稳定；而M2巨噬细胞通过促进胞葬作用清除凋亡细胞，并分泌抗炎细胞因子抑制炎症，支持斑块稳定。M1/M2失衡可导致病理性重构，促进肝、心等器官纤维化及动脉斑块形成。肝脏纤维化研究中，库普弗细胞可呈现M1或M2表型，M1巨噬细胞促进肝损伤，M2巨噬细胞则通过ECM蓄积增强纤维化；壳寡糖可通过调节库普弗细胞极化，减少M1与M2巨噬细胞的过度活化，限制肝星状细胞激活，减轻肝纤维化。这些研究强调了巨噬细胞极化在肝纤维化中的重要性，提示靶向促炎与抗炎巨噬细胞表型平衡是恢复免疫稳态、缓解纤维化进展的有效策略。
2.5 巨噬细胞可塑性的疾病与治疗转化意义
靶向巨噬细胞功能状态是多种疾病极具前景的治疗策略，但其转化成功取决于充分考虑巨噬细胞活化的环境依赖性与连续谱特性。如2.3节所述，TAM的功能异质性催生了癌症治疗新策略，包括靶向巨噬细胞招募与极化、阻断髓系抑制信号（如髓系检查点抑制）、工程化巨噬细胞用于细胞免疫治疗等。巨噬细胞固有的可塑性提供了巨大治疗机遇，但也给临床转化带来重大挑战，尤其在复杂动态的疾病环境中。核心局限在于巨噬细胞响应在不同疾病阶段、组织环境及细胞起源间存在显著差异，相同干预措施可能因炎症微环境、给药时机及局部组织信号背景的不同，产生差异甚至相反的结局。早期炎症环境可能利于促炎活化，而后期则倾向于修复或免疫调节应答。此外，巨噬细胞异质性也直接影响癌症以外的疾病结局：结核病中，肉芽肿内肺泡与间质巨噬细胞谱系的分化响应受起源与表观遗传编程调控，而非简单的M1/M2活化状态，这对优化疫苗与药物方案具有直接指导意义。尽管可塑性为治疗带来吸引力，但其临床转化仍需谨慎：基于巨噬细胞的细胞疗法（包括体外极化与CAR-巨噬细胞策略）已进入肾病、卒中、动脉疾病及癌症的临床试验，结果既显示前景也存在环境依赖性差异。类风湿关节炎、骨关节炎等关节疾病中，巨噬细胞重编程策略在临床前研究中显示出免疫调节与抗炎效应，但临床转化仍不完善，需开展专门临床试验验证该策略的有效性。此外，炎症疾病模型的实验证据表明，巨噬细胞靶向干预可同时抑制促炎信号并调节组织重塑与修复通路，说明表型转换本身并不能可靠预测功能或临床结局。综上，巨噬细胞靶向治疗需在功能异质性框架下解读，而非基于二元极化状态。全身性或非特异性靶向策略可能因巨噬细胞在组织中的广泛分布、可塑性与功能多样性而产生脱靶免疫效应。尽管存在局限，多种治疗策略仍显示出转化前景，包括细胞因子调控、关键炎症信号通路靶向抑制、代谢重编程策略，以及新兴的纳米技术递送系统（用于巨噬细胞特异性靶向与功能重编程）。临床与转化证据提示，成功的巨噬细胞靶向治疗不依赖于僵化的M1/M2转换，而在于精准的时空治疗控制、疾病分期认知及局部免疫微环境调控，反映了从表型靶向向功能与环境驱动治疗策略的转变。
3 巨噬细胞极化研究的常用方法
3.1 体外极化研究常用的巨噬细胞细胞系
巨噬细胞研究高度依赖体外方法揭示其功能与行为多样性，这些方法可精确调控细胞生长条件，诱导巨噬细胞向功能特性
