《Frontiers in Immunology》：Human seminal plasma suppresses neutrophil antimicrobial functions and promotes bacterial survival
编辑推荐：
人精浆（HSP）在塑造生殖免疫环境中扮演重要角色，但其对调节中性粒细胞抗菌功能和病原体清除的影响仍不清楚。在本研究中，研究人员调查了HSP对关键中性粒细胞效应反应（包括活性氧（ROS）产生、中性粒细胞胞外陷阱（NET）形成、吞噬作用和细菌杀灭）的免疫调节作用。
人精浆（HSP）在塑造生殖免疫环境中扮演重要角色，但其对调节中性粒细胞抗菌功能和病原体清除的影响仍不清楚。在本研究中，研究人员调查了HSP对关键中性粒细胞效应反应（包括活性氧（ROS）产生、中性粒细胞胞外陷阱（NET）形成、吞噬作用和细菌杀灭）的免疫调节作用。研究人员在存在或不存在HSP的情况下，用钙离子载体A23187、佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）或尿路致病性大肠杆菌（UPEC）刺激人中性粒细胞。此外，研究人员使用了来自NOX2和PAD4基因敲除小鼠的中性粒细胞，以阐明HSP介导的NETosis调控的分子途径。HSP显著抑制了由A23187、PMA和UPEC诱导的ROS产生和NET形成，同时也降低了中性粒细胞的吞噬能力并损害了细菌杀灭能力。在机制上，研究人员发现HSP介导的NETosis抑制是PAD4依赖性的，但独立于NOX2。此外，当HSP来自服用乙酰水杨酸（阿司匹林）的可显著降低HSP中前列腺素E?水平的供体时，HSP对PMA刺激的人中性粒细胞的抑制效应减弱。与这一观察一致，药理学阻断前列腺素信号传导恢复了HSP处理的中性粒细胞的ROS产生。总的来说，这些发现将HSP确定为中中性粒细胞效应功能的生理抑制剂，并支持HSP通过抑制中性粒细胞氧化爆发、NET形成和抗菌活性在维持生殖道内免疫稳态和耐受性方面的作用。
# 人精浆调控中性粒细胞效应功能促进细菌存活的机制解读
## 1 研究背景与问题
在哺乳动物生殖过程中，精浆（HSP）发挥着塑造生殖道免疫环境的关键作用。一方面，精浆通过诱导耐受性树突状细胞分化和调节性T细胞（Tregs）生成等调控途径，有助于建立母体对父源性同种抗原的免疫耐受，从而支持胚胎着床。另一方面，性交后精液暴露也与女性生殖道中短暂的炎症反应相关。研究表明，交配或人工授精后，精液成分和精子可诱导子宫内中性粒细胞或粒细胞快速、短暂的积聚。这种反应具有环境依赖性，因物种、激素状态、微生物群和感染状况而异。在这种复杂的黏膜环境中，中性粒细胞可能通过清除病原体、细胞碎片、多余精子及精浆成分来维持生殖道稳态，从而帮助维持组织完整性和限制微生物入侵。
中性粒细胞是先天免疫的核心介质。在识别病原体相关分子模式（PAMPs）后，中性粒细胞部署多种抗菌效应机制，包括吞噬作用、活性氧（ROS）产生、脱颗粒和中性粒细胞胞外陷阱（NETs）形成。NETs由脱浓缩的DNA组成，通过肽酰基精氨酸脱亚氨酶4（PAD4）的激活以及翻译后修饰的蛋白生成。NETs形成可能伴随细胞死亡，此过程称为NETosis。无论是人类还是小鼠模型，NETosis均可由NADPH氧化酶（NOX2）复合体产生的ROS触发。
越来越多的证据表明，NETosis可影响生殖健康。精子可诱导NETosis，导致精子被困和活力显著降低。中性粒细胞与精子之间的相互作用，以及女性生殖道中不良免疫反应的激活，在很大程度上由HSP调节。HSP含有多种免疫抑制因子，如前列腺素（PGs），它们在受精和早期胚胎发育过程中调节局部免疫反应。已有报道表明HSP抑制单核细胞和粒细胞的关键过程，如吞噬作用和氧化爆发。然而，HSP调节这些效应功能的机制，以及对抗菌宿主防御的影响，仍然知之甚少。
## 2 主要技术方法
本研究采用以下关键技术方法：1）利用从健康供体外周血分离的原代人中性粒细胞，以及从基因敲除（NOX2-KO、PAD4-KO）小鼠骨髓分离的小鼠中性粒细胞；2）采用钙离子载体A23187、佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）或尿路致病性大肠杆菌（UPEC，菌株CFT073）刺激中性粒细胞；3）通过二氢乙啶（DHE）氧化定量ROS产生；4）利用抗髓过氧化物酶（MPO）和抗双链DNA（dsDNA）抗体进行免疫荧光染色和定量分析NETs；5）使用FITC标记的LPS包被生物颗粒进行吞噬功能测定；6）通过菌落形成单位（CFU）计数评估细胞内外细菌负荷；7）使用来自接受或未接受乙酰水杨酸（ASA）处理的供体的人精浆，并检测前列腺素E?（PGE?）水平；8）利用前列腺素受体拮抗剂（包括IP、EP4和EP2受体拮抗剂）的药理学阻断策略。
## 3 研究结果
### 3.1 HSP 负调控人中性粒细胞的 NETosis 形成和抗菌功能
研究人员首先探究HSP是否调节活化人中性粒细胞的效应功能。将分离的人中性粒细胞与HSP或培养基预孵育，然后用两种公认的NETosis诱导剂A23187或PMA刺激。A23187或PMA刺激有效诱导了中性粒细胞的NETosis，表现为细胞外DNA与MPO共定位的释放。相比之下，与HSP预孵育显著减少了A23187和PMA刺激后的NET形成。进一步用UPEC（菌株CFT073）在MOI 10和MOI 100条件下挑战中性粒细胞，发现HSP预孵育显著抑制了UPEC诱导的NETosis，并且这与细胞外细菌负荷增加相关。通过流式细胞术分析细胞死亡（7-AAD+/Annexin V+双阳性细胞），排除了HSP处理导致中性粒细胞活力下降的可能性。这些数据将HSP确定为中性粒细胞NETosis和抗菌功能的负调节因子。
### 3.2 HSP 减少 A23187、PMA 和 UPEC 刺激的中性粒细胞中 ROS 的产生
鉴于A23187、PMA和UPEC是有效的ROS诱导剂，研究人员接下来评估了HSP对这些刺激下的人中性粒细胞ROS产生的影响。通过DHE氧化测量发现，HSP预孵育的中性粒细胞在A23187、PMA和UPEC刺激后ROS水平均显著降低。同时，HSP处理的中性粒细胞显示细胞内UPEC负荷显著增加，表明氧化爆发被抑制与中性粒细胞介导的细菌清除受损相关。
### 3.3 HSP 损害人中性粒细胞的吞噬能力
为确定HSP是否调节中性粒细胞的其他效应功能，研究人员评估了HSP预孵育后暴露于FITC标记的LPS包被生物颗粒的吞噬能力。通过测量内吞生物颗粒的平均荧光强度（MFI），发现HSP处理组在15分钟和30分钟时的MFI值均显著低于对照组。同时，HSP处理组中内吞了FITC-LPS生物颗粒的中性粒细胞百分比也降低。这些结果表明，HSP通过降低颗粒摄取程度和吞噬细胞的百分比来损害中性粒细胞的吞噬功能。
### 3.4 HSP 通过 PAD4 而非 NOX2 抑制 NETosis
为了阐明HSP调节NETosis的机制，研究人员利用来自野生型（WT）、NOX2敲除（Cybb-/-）和PAD4缺陷（Padi4-/-）小鼠的中性粒细胞进行了实验。A23187刺激后，WT小鼠中性粒细胞在HSP处理后NET形成显著减少。重要的是，HSP处理有效抑制了Cybb-/-细胞中A23187诱导的NETosis，表明HSP对NET形成的抑制效应是通过NOX2非依赖性机制介导的。值得注意的是，Padi4-/-中性粒细胞在A23187刺激后仍能形成NETs，但程度低于WT细胞；然而，HSP未能显著抑制Padi4-/-细胞的NET形成。总之，这些发现表明PAD4是HSP介导的小鼠中性粒细胞NETosis抑制所必需的。
### 3.5 前列腺素信号传导参与 HSP 介导的对中性粒细胞 ROS 产生的抑制
研究人员接下来探究了HSP调节活化中性粒细胞ROS产生的机制。由于PGs在HSP中含量丰富，研究人员检测了HSP对ROS产生的抑制效应是否依赖于PG信号传导。用前列腺素受体拮抗剂（包括IP、EP4和EP2受体的抑制剂）混合物预处理人中性粒细胞，然后暴露于HSP并刺激PMA。结果表明，在存在前列腺素受体拮抗剂的情况下，HSP对PMA诱导的ROS产生的抑制效应显著减弱。为进一步证实，研究人员使用了来自接受ASA（阿司匹林）处理的供体的HSP。ASA处理供体后，HSP中的PGE?水平降低而总蛋白不变。来自ASA处理供体的HSP抑制PMA诱导的ROS产生的效果显著弱于未处理供体的HSP。这些发现表明，HSP中的前列腺素有助于负调控活化中性粒细胞的ROS产生。
## 4 讨论与结论
本研究证明了HSP对中性粒细胞效应功能具有强大的免疫调节作用。HSP抑制了由多种生理相关刺激（包括药理学激动剂和UPEC）诱导的ROS产生和NET形成，这两者是病原体控制和杀伤的关键机制。这与最近关于精浆抑制猪中性粒细胞-精子共培养物中NETosis的报道一致，提示这一现象在物种间可能是进化保守的。HSP对中性粒细胞的免疫调节作用伴随着UPEC清除受损，突显了HSP介导的中性粒细胞调节的功能后果。
关于机制，数据表明抑制通过EP2/EP4受体的前列腺素信号传导或通过ASA处理供体降低HSP中的前列腺素水平，可减弱HSP介导的活化中性粒细胞ROS产生的抑制。具体而言，PGE?通过激活EP2和EP4受体抑制人中性粒细胞的ROS产生和NET形成。值得注意的是，HSP通过PAD4依赖性但NOX2非依赖性机制抑制NET形成，表明HSP并非广泛抑制中性粒细胞，而是选择性地调节控制NETosis的特定分子途径。这种选择性调节强化了精浆对中性粒细胞效应功能进行精细调节的概念。
尽管HSP介导的免疫抑制效应可能有利于微生物持续存在，但必须在生殖的生理背景下理解。精浆对于建立女性生殖道的免疫耐受至关重要，这一过程支持精子存活、受精和早期胚胎发育。从进化角度看，限制受精后中性粒细胞活化、ROS产生和NET形成的机制可能因减少对精子和父源抗原的免疫反应而提高生殖成功率。
综上所述，本研究的发现将HSP确定为中中性粒细胞抗菌功能的关键调节因子，并强调了其在平衡生殖免疫耐受和宿主防御中的作用，对细菌存活和生殖成功具有潜在影响。论文发表在《Frontiers in Immunology》。
