综述：通过黏膜疫苗接种靶向登革热：NS1与基于细菌孢子的递送平台的潜力

《Frontiers in Immunology》：Targeting dengue through mucosal vaccination: the potential of NS1 and bacterial spore-based delivery platforms

　　

严重登革热的特征是明显的血管渗漏、出血表现和器官损伤，主要是由免疫病理机制驱动的。传统的疫苗方法侧重于诱导针对DENV结构抗原的中和抗体，但显示出局限性，并且在某些条件下可能通过抗体依赖性感染增强（ADE）加剧感染。最近，越来越多的证据强调了T细胞介导的免疫和抗非结构蛋白1（NS1）特异性反应在抑制DENV复制和降低疾病严重程度中的重要性。然而，已知DENV NS1与严重登革热病理学相关。在此背景下，针对NS1的免疫接种提供了一种战略优势，通过引发可能有助于早期控制病毒复制，同时减轻NS1介导的血管病理学的免疫反应。因此，需要一种能够刺激保护性免疫反应，同时避免NS1潜在病理效应的疫苗递送平台。枯草芽孢杆菌孢子抗原递送平台因其安全性、稳定性和固有的佐剂特性而脱颖而出。本综述总结了基于NS1的登革热疫苗开发的最新进展，以及基于枯草芽孢杆菌孢子的抗严重登革热免疫策略的进展。

1. 引言
登革热病毒（DENV）感染仍然是全球最重要的虫媒病毒威胁之一，每年估计有3.9亿例感染。尽管对登革热疫苗和治疗方法进行了数十年的研究，但普遍接受的安全有效的疫苗和有效的抗病毒疗法仍然难以实现。目前许可的疫苗，如Dengvaxia^?（CYD-TDV）和QDENGA^?（TAK-003），提供部分保护，其效力因血清型、年龄组和预先存在的免疫力而异。这些局限性，加上全球登革热病例数量的稳步增加，凸显了对替代疫苗策略的迫切需求，这些策略既安全又能够在不同人群中提供广泛、有效的保护。
在DENV蛋白中，包膜（E）蛋白因其参与病毒与宿主细胞受体的附着和融合，而成为疫苗开发的主要抗原。虽然预期E特异性抗体能阻止病毒与其受体结合，从而抑制病毒附着、进入和复制，但这种策略因E蛋白上存在高度交叉反应的非中和表位而变得复杂。这些抗体非但不能预防感染，反而能与病毒结合，并将其Fc区域暴露给免疫细胞上的Fcγ受体（FcγR）。与FcγR的相互作用促进病毒摄取并增强病毒复制，这种现象称为抗体依赖性感染增强（ADE）。ADE在异源DENV血清型的二次感染期间尤其相关，其中预先存在的交叉反应但非中和的抗体加剧了病毒复制和免疫病理学，导致疾病严重程度增加，而不是提供保护。除此之外，DENV血清型之间的结构异质性以及病毒成熟和宿主细胞进入过程中E的构象变化，进一步增加了设计针对所有血清型和变体具有广泛中和作用的疫苗的复杂性。
在这一挑战背景下，DENV非结构蛋白1（NS1）作为一种有前景的疫苗候选物引起了关注，证明了其在不引发抗体依赖性感染增强（ADE）效应的情况下诱导保护性免疫的能力。鉴于NS1不是病毒粒子的结构成分，针对NS1的抗体不结合病毒颗粒，因此不太可能导致通常与抗包膜抗体相关的Fc受体驱动的ADE效应。已经研究了几种基于NS1的疫苗策略，包括核酸递送系统、重组融合蛋白和基于多肽的方法。虽然NS1具有高度抗原性并能刺激保护性免疫，但它也能引起严重的病理学。因此，如果将NS1视为疫苗靶点，还需要安全的递送方法。在正在探索的疫苗递送平台中，通过黏膜途径刺激免疫的平台正在作为新的替代方案出现，因为它们不仅靶向清除病毒，而且还能减轻NS1相关病理学的潜在风险。
本综述概述了登革热疫苗开发的关键进展，强调了越来越多的证据表明NS1是一个强大的疫苗靶点，并突出了细菌孢子作为有效黏膜疫苗递送平台的潜力。基于细菌孢子的疫苗平台，特别是利用枯草芽孢杆菌孢子的平台，因其稳定性、安全性和内在佐剂特性，已成为一种有前景的黏膜抗原递送方法。本综述探讨了利用黏膜免疫来提高登革热疫苗有效性的潜力，特别关注那些在低收入和中等收入国家（LMICs）实施可行且具有影响力的策略。

2. 登革热病毒的复制与发病机制
登革热是影响人类的最古老的蚊媒病毒性疾病之一。DENV是登革热的病原体，是一种单股正链RNA病毒，包含三种结构蛋白：衣壳（C）、包膜（E）和膜/前膜（M/prM），以及七种非结构蛋白：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。该病毒通过受感染的雌性埃及伊蚊或白纹伊蚊的叮咬传播给人类。感染通常始于蚊子唾液中含有病毒颗粒通过其口器注入皮肤真皮层。在进入部位，DENV主要感染角质形成细胞、成纤维细胞和真皮树突状细胞（DCs），包括朗格汉斯细胞（LCs）。从最初的进入部位，病毒复制并随后传播到其他器官。受感染的LCs从表皮迁移到淋巴结，促进早期传播和适应性免疫的启动。最初的病毒复制由蚊虫唾液蛋白促进。这些蛋白通过抑制炎症小体激活和细胞因子释放来抑制宿主免疫细胞中的先天抗病毒反应，从而为病毒复制创造有利环境。蚊虫唾液腺提取物（SGE）被证明可以增加真皮中的病毒颗粒，增强树突状细胞和巨噬细胞的感染，并促进它们迁移到淋巴结。蚊虫唾液蛋白，如34 kDa蛋白，抑制干扰素调节因子（IRFs），即IRF-3和IRF-7，而埃及伊蚊毒液过敏原-1（AaVA-1）激活宿主免疫细胞中的自噬以促进病毒复制。这个初期的局部病毒扩增阶段影响病毒是被有效控制还是发生系统性播散。
一旦建立有效的局部复制，DENV通过淋巴系统进入血液，在那里感染单核细胞和髓系DCs，促进病毒传播到远处组织。特别是，受感染的DCs促进单核细胞和巨噬细胞的感染，从而放大病毒血症并允许病毒传播到器官和组织，如肝脏、脾脏和血管内皮。病毒对先天免疫防御的抑制使其能够传播并在多个组织中引起后续感染。DENV拮抗I型干扰素（IFN-I）信号传导，特别是通过NS2A、NS2B、NS4A、NS4B和NS5，破坏先天免疫防御，使病毒更有效地传播。肝脏是DENV的主要组织靶点，其中肝细胞和库普弗细胞支持有效的病毒复制。脾脏和淋巴结也是病毒复制和淋巴细胞激活的重要早期部位。除了这些组织，单核细胞、巨噬细胞和DCs是病毒传播和免疫激活的主要贡献者，而内皮细胞的感染尽管效率较低，但对血管通透性有显著影响。直接DENV感染也已在骨髓巨核细胞中得到证实，这可能损害血小板生成并导致血小板减少症的发展。此外，已观察到骨髓抑制，包括造血细胞减少，但其对白细胞减少的贡献尚未完全明确。这种广泛的器官受累是DENV感染系统性表现的基础。

3. 登革热疫苗开发的最新进展
尽管国家和区域层面采取了积极的登革热控制措施，但当前主要侧重于媒介控制、行为改变和社区教育的登革热预防策略已被证明是不充分的。这一点从全球报告的登革热病例数和登革热相关死亡人数的持续增加中显而易见。最令人担忧的是，在以前没有记录过登革热的地区报告了登革热病例，这表明登革热的地理分布正在扩大。此外，在登革热流行地区，出现了一个显著的人口统计学转变：年轻成年人现在占病例的最大比例，取代儿童成为主要受影响群体。这个高度活跃和流动的人口在疫情爆发期间是DENV传播的主要来源，考虑到至少60%的登革热感染是无症状或轻度的，尽管伴有高水平的病毒血症。此外，登革热爆发期间老年人群的高死亡率也有报道。因此，随着东南亚人口迅速老龄化，登革热在那里已经流行了四十多年，高死亡率的登革热威胁是一个严重的公共卫生问题。因此，显然迫切需要能够降低感染期间病毒血症、降低疾病严重程度和死亡率，并遏制DENV传播的策略。
疫苗接种已被证明是减少许多传染性病原体感染负担的最有效预防策略之一。在这方面，至少有两种登革热疫苗已获许可：Dengvaxia^?（赛诺菲巴斯德，法国）和Qdenga^?（武田药品工业株式会社，日本）。然而，登革热疫苗的开发研究仍在持续进行，主要是因为配制一种能够对四种DENV血清型中的每一种都诱导出一致保护性免疫的候选疫苗面临着艰巨挑战。已经开发了多种登革热疫苗平台，其中一些已经与两种已获许可的疫苗一起进入临床前和临床试验阶段。这些包括减毒活疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗、mRNA疫苗、病毒样颗粒疫苗、重组亚单位疫苗和基于多肽的疫苗。减毒活疫苗包括CYD-TDV、TAK-003和TV003/TV005。尽管CYD-TDV和TAK-003已在受影响地区的多个国家被批准使用，但其采纳情况并不热烈。CYD-TDV是一种嵌合黄热病-登革热疫苗，仅推荐用于9至45岁且有先前登革热暴露史的个体。这是因为据报道，当用于血清阴性个体时，其发展成严重登革热的风险增加。尽管诱导了高中和抗体滴度，CYD-TDV显示出有限保护效力，特别是针对DENV-2，并且未能预防严重疾病。最近，CYD-TDV疫苗的制造商赛诺菲巴斯德宣布计划在2026年第三季度停止生产该疫苗，理由是全球需求低迷。另一方面，TAK-003是一种基于DENV-2骨架的减毒四价疫苗，最近被引入。该疫苗对经病毒学确认的登革热的累计效力约为61%，对住院病例的效力约为84%。然而，这些数据表明该疫苗对DENV-3的效力在无登革热感染的接受者中有限。由于研究样本量小，也不能排除基线血清阴性的TAK-003接受者感染DENV-3或DENV-4后发生增强性DENV相关疾病的潜在风险。TV003/TV005是由美国国家过敏和传染病研究所（NIAID）开发的疫苗，通过在DENV的3'非翻译区（UTR）引入靶向缺失和非结构蛋白突变而开发。临床试验的早期结果显示，TV003通过单次免疫诱导了针对所有四种血清型的强效且平衡的免疫反应，而改良版本TV005在单次给药后提供了更强的抗体反应，特别是针对DENV-2，同时保持了对其他DENV血清型的免疫原性。巴西布坦坦研究所获得了TV003的许可，并开发了Butantan-DV，该疫苗已在大型临床试验中进行评估。2期研究证实了该疫苗的安全性，大多数参与者仅出现轻度皮疹，同时对所有四种血清型表现出高抗体反应，特别是在血清阳性志愿者中。巴西正在进行的一项3期临床试验的初步结果显示令人鼓舞，总体疫苗效力约为80%，在血清阳性个体中保护效力更高。该疫苗对DENV-1显示出强效效力，对DENV-2显示出中等效力，而针对DENV-3和DENV-4的数据仍在收集中，因为试验期间这些血清型的流行有限。与此同时，默克夏普和多姆公司（MSD，美国）目前正在进行MOBILIZE-1 3期研究，以评估TV003/TV005的四价登革热候选疫苗V181在亚太地区2至17岁个体中预防登革热相关疾病的安全性和有效性。

4. 登革热病毒非结构蛋白1作为疫苗靶点
DENV NS1是一种48-kDa的糖蛋白，其结构由β-卷、翼结构域和β-梯结构域组成；每个结构域都参与细胞膜相互作用和宿主免疫调节。与结构蛋白不同，NS1不是病毒粒子的组成部分，而是以六聚体形式分泌，并作为二聚体在感染细胞表面表达。DENV NS1有三种形式：细胞内NS1，支持病毒RNA复制；膜相关NS1，帮助免疫逃逸；以及分泌型NS1（sNS1），在血液中循环。sNS1通过与血管内皮细胞结合并通过激活促炎细胞因子和趋化因子诱导血管通透性过高，发挥着突出的致病作用。NS1与TLR4相互作用，激活巨噬细胞和内皮细胞，触发细胞因子释放并直接破坏内皮单层完整性。sNS1还激活TLR2和TLR6通路，导致促炎细胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的上调。其中一种细胞因子，巨噬细胞迁移抑制因子（MIF），似乎通过促进VE-钙黏蛋白和ZO-1等蛋白的内化和自噬降解，显著促进连接解体。VE-钙黏蛋白和闭锁小带-1（ZO-1）的内化或磷酸化可能通过网格蛋白介导的途径发生。宿主酶（包括肝素酶、唾液酸酶和磷脂酶A2（PLA2））的释放进一步加剧了内皮连接的降解和解体。这一机制已在各种内皮细胞模型中得到研究，其中暴露于所有四种DENV血清型的NS1导致跨内皮电阻降低。此外，NS1通过干扰补体系统参与免疫逃逸。它可以直接结合补体成分C4和C4b，从而抑制保护性补体功能，同时产生过量的激活产物，如C3a和C5a。这些补体激活的肽增加血管通透性，并与NS1介导的内皮糖萼完整性破坏一起，驱动严重登革热特征性的血管渗漏。
NS1还涉及分子模拟和自身免疫相关的致病效应。高度保守的C末端表位与参与止血和内皮完整性的宿主蛋白具有结构相似性，交叉反应抗体可诱导内皮凋亡、血小板功能障碍和补体介导的细胞毒性。靶向NS1 C末端区域的抗体已被证明与血小板和内皮细胞上表达的宿主蛋白以及凝血相关分子发生交叉反应，可能导致严重登革热中的血小板减少症、内皮功能障碍和血管渗漏。抗NS1自身抗体水平升高与登革出血热和登革休克综合征相关，强化了NS1分子模拟在疾病免疫发病机制中的作用。
认识到其在登革热疾病严重程度中的核心作用，NS1越来越多地被探索作为下一代登革热疫苗的候选抗原。然而，抗原的最佳结构呈现仍然是一个关键考虑因素。虽然NS1从细胞内同源二聚体自然转变为驱动系统性血管渗漏的分泌型六聚体（sNS1），但当前的策略优先考虑去毒突变体或截短片段，以避免分子模拟，同时保留保护性表位。NS1包含多个在单个DENV血清型中预测的B细胞和T细胞表位，支持其作为广泛相关疫苗靶点的潜力。最近的研究进一步强调了展示来自NS1翼结构域的保守T细胞表位以确保跨血清型广泛HLA覆盖的潜力。针对NS1的人单克隆抗体已被证明可以阻断内皮结合并阻止糖萼降解，从而减轻血管渗漏。预计这些抗体能功能性阻断sNS1介导的TLR4激活和内皮损伤，这要求疫苗抗原在感染期间表达并随后模拟天然sNS1动力学。此外，实验室研究表明，Fc介导的效应功能，包括抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体介导的杀伤DENV感染细胞，有助于减少病毒并改善NS1诱导的病理学。同时，维持细胞表面的抗原表达对于在病毒周期早期引发这些有效的ADCC和补体依赖性细胞毒性（CDC）反应以清除感染细胞至关重要。结构作图研究进一步描绘了NS1上潜在的致病表位，特别是在C末端区域内，而工程化的NS1构建体，如翼结构域（NS1-WD）以及截短或嵌合变体，可引发保护性免疫而不结合血小板或内皮。诱变策略进一步减少了与宿主蛋白的潜在交叉反应性，同时保留了免疫原性。在此基础之上，结合结构作图和功能分析测定的最新进展，现在正出现一个用于安全设计基于NS1的疫苗的有前景的框架。这些发现表明，抗原定位、去毒NS1变体的选择以及平衡的体液和细胞免疫的诱导，可能是基于孢子的递送系统的重要设计考量。
几项临床前研究已经在小鼠模型中展示了各种基于NS1的疫苗平台的有前景结果。使用来自所有四种DENV血清型的全长NS1与单磷酰脂质A（MPLA）/AddaVax佐剂配制的疫苗，在干扰素-α/β受体缺陷的C57BL/6小鼠中通过静脉内给药，赋予了60-100%的存活率，同时病毒血症和循环NS1抗原水平显著降低。此外，将NS1与免疫调节佐剂（包括去毒热不稳定毒素衍生物LTG33D）结合的重组蛋白疫苗，进一步证明了增强的免疫原性和保护效力。将NS1与活细菌载体相结合的异源初免-加强策略也显示出增强的保护性免疫。由NS1蛋白初免，随后使用表达NS1的重组沙门氏菌口服加强，并辅以两性霉素B（Amb）作为免疫增强剂的免疫方案，显著增强了体液和细胞免疫反应。该策略在小鼠中赋予了针对登革热病毒攻击的有效保护，强调了黏膜加强和先天免疫调节在加强NS1导向疫苗效力方面的潜力。针对修饰后的NS1翼结构域（NS1-WD）的多肽疫苗，用完全弗氏佐剂（CFA）配制，在C3H/HeN和STAT1^-/- C57BL/6小鼠模型中实现了完全存活，并显著降低了病毒血症、抗原血症和出血表现。最近，基于VLP和纳米颗粒的制剂，如展示在壳聚糖纳米颗粒（TMC NPs）上的NS1_1-279，增强了体液免疫反应，并在小鼠中赋予了针对致死性登革热病毒攻击的保护，突出了颗粒状抗原呈递的优势。与此同时，嵌合构建体cEDIII-ΔC NS1显示出改善的免疫反应，强调了抗原设计优化在进一步加强基于NS1的疫苗策略方面的潜力。
更现代的基于DNA的疫苗平台也显示出有利的结果。双质粒构建体如pD2NS1/pD2NS1+pIL-2在C3H小鼠中赋予50-80%的存活率，发病率降低70-80%，而其他DNA疫苗如pcTPA-NS1和pcENS1分别在BALB/c小鼠中实现了完全（100%）或显著（86.7%）的保护。此外，编码登革热病毒非结构蛋白NS1、NS3和NS5的多价DNA疫苗构建体如pNS（1,3,5）已在临床前阶段进行了评估，并在实验模型中展示了免疫原性潜力。此外，编码NS1的基于mRNA的疫苗接种诱导了强大的NS1特异性抗体反应，并在临床前小鼠模型中提供了保护。

5. 黏膜疫苗与黏膜免疫
疫苗接种仍然是最有效的公共卫生干预措施之一，目前有33种针对病毒和细菌性人类疾病的许可疫苗。这些疫苗大多通过肌肉注射或静脉注射给药，只有少数配制成口服给药。然而，口服疫苗可以提供许多优势，特别是对于儿科人群，因为其易于给药可以显著提高接种率。尽管有这些优势，开发有效的口服疫苗仍然具有挑战性。抗原必须耐受胃的高酸性环境，克服限制抗原摄取的强大黏膜屏障，并避免在黏膜表面引发免疫耐受。免疫耐受是口服递送的抗原被识别为无害物质，引发抑制性系统或黏膜免疫反应，这是防止过敏反应的重要机制，但也可能削弱口服给药疫苗的有效性。尽管存在这些挑战，仍有抗原通过克服黏膜屏障和规避耐受性而成功递送，特别是当与强效黏膜佐剂或专门的递送平台一起递送时。
口服疫苗接种已被证明能引发黏膜和系统免疫反应。例如，用表达多重耐药鲍曼不动杆菌TonB依赖性受体（TBDR）抗原的灭活枯草芽孢杆菌孢子进行口服免疫，在小鼠中诱导了黏膜和系统水平的抗原特异性免疫反应。免疫动物表现出CD4⁺和CD8⁺ T细胞群增加、B细胞反应增强，以及血清和黏膜分泌物中抗原特异性IgG和IgA升高，这转化为针对细菌攻击的显著保护，包括肺细菌负荷显著降低和组织结构保留。作为这些发现的补充，口服表达SARS-CoV-2刺突蛋白的枯草芽孢杆菌孢子诱导了抗原特异性的系统和黏膜免疫反应，且无不良效应证据。在天然肠道感染期间，微生物成分通过模式识别受体（PRRs）被肠上皮细胞识别，以检测病原体相关分子模式（PAMPs），导致抗原呈递细胞（APCs）如肠道树突状细胞、B细胞和巨噬细胞的募集。这些APCs随后激活下游黏膜免疫细胞，启动先天免疫反应，并通过激活CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞驱动适应性免疫。黏膜免疫激活APCs和促进系统淋巴细胞活化的能力，为黏膜递送与诱导保护性细胞免疫之间提供了机制联系。虽然DENV不是黏膜传播的病原体，但这种免疫启动对登革热特别相关，因为有效保护日益被认为不仅依赖于中和抗体，还依赖于强大的T细胞介导反应。在此背景下，黏膜疫苗平台可以作为上游策略，塑造系统免疫的质量和广度，包括增强针对保守病毒抗原（如NS1）的CD8⁺ T细胞反应。
T细胞，特别是CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），在识别和清除感染细胞、从而限制病毒复制和组织传播中发挥核心作用。来自人类和动物研究的证据表明，强大的登革热特异性T细胞反应与较低的病毒血症水平和较轻微的临床结果相关。例如，对非结构蛋白（如NS1、NS3、NS4A/NS4B和NS5）内保守表位产生交叉反应性CD8⁺ T细胞反应的个体，表现出增强的病毒清除和降低的严重登革热风险。因此，T细胞反应提供更广泛和更持久的交叉血清型保护，因为它们经常靶向保守的内部表位，这些表位比由中和抗体提供的表位更不易发生抗原变异。T细胞免疫还通过调节细胞因子反应和减轻与血浆渗漏和出血表现相关的免疫病理过程，参与免疫调节。因此，下一代登革热疫苗可能受益于优先诱导强效T细胞反应以限制病毒复制和预防严重后果的策略，而不是仅仅专注于阻止病毒进入细胞。
基于T细胞介导免疫的重要性，NS1作为一种有前景的T细胞抗原。NS1在感染期间大量表达，并通过主要组织相容性复合体（MHC）I类途径呈递，允许有效激活CD8⁺ T细胞。NS1在所有四种DENV血清型之间也表现出约70-80%的序列保守性，这强烈表明其引发广泛交叉血清型保护的潜力。将NS1纳入疫苗制剂可以刺激体液和细胞免疫，后者在减少病毒载量和疾病严重程度方面起决定性作用。与此一致，基于NS1的疫苗在临床前动物模型中已显示出显著的保护效力，导致生存结果改善和临床疾病表现显著减少。这些发现强调了登革热疫苗设计的范式转变，超越旨在预防感染的传统抗体中心方法，转向旨在清除感染细胞和预防严重疾病表现的T细胞导向策略。将这种潜力转化为可行疫苗将需要未来研究致力于鉴定保守的T细胞表位、通过黏膜疫苗平台优化抗原呈递，以及开发可靠的T细胞介导保护的免疫相关性指标。

6. 靶向登革热疫苗接种的黏膜免疫
尽管登革热传统上不被归类为黏膜病原体，但越来越多的证据表明黏膜表面及其相关免疫反应在疾病发病机制和保护中都起着关键作用。临床和组织病理学研究已证明DENV感染期间黏膜受累，NS1与来自肺和肝血管的微血管内皮细胞结合，从而诱导组织特异性血管渗漏。此外，严重登革热患者经常观察到胃肠道症状，并且通常与血浆渗漏和疾病严重程度相关，提示胃肠道受累可能导致严重的疾病表现。严重登革热病例的尸检结果常显示黏膜水肿、出血以及黏膜相关淋巴组织（MALT）（包括肠道和鼻咽）中存在病毒抗原。这些发现表明黏膜组织不仅是病毒复制的部位，也是DENV NS1介导的血管病理学的潜在靶点。因此，虽然在这些部位引发的免疫反应对病毒清除至关重要，但它们也可能加剧疾病严重程度。
黏膜免疫系统，特别是在胃肠道和呼吸道，包含有组织的淋巴结构，如派尔集合淋巴结、肠系膜淋巴结和鼻咽相关淋巴组织（NALT）。这些部位富含APCs，包括树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞，它们通过捕获抗原并激活T和B细胞来启动免疫反应。黏膜免疫的一个标志是分泌型IgA（sIgA）的产生，它可以在细胞外和细胞内中和病原体，防止病毒在黏膜表面附着、进入和复制。在登革热感染个体中检测到IgA抗体，并且被认为在系统性播散之前有助于早期病毒中和。相比之下，系统IgG在长期保护和病毒清除中起关键作用。除了体液反应，胃肠道中的APCs捕获抗原并将其呈递给主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类分子，分别激活CD8⁺细胞毒性T细胞和CD4⁺ T辅助17（Th17）细胞。这些T细胞亚群参与免疫监视、清除感染细胞和细胞因子介导的反应。
鉴于这些观察结果，诱导黏膜免疫，特别是通过口服或鼻内途径，通过补充系统免疫反应，为增强针对DENV的保护提供了一种有前景的策略。虽然DENV是在蚊子叮咬皮肤组织后进入宿主，而不是通过呼吸道或胃肠道黏膜，但黏膜疫苗接种在免疫学上仍然相关。其理由并不在于sIgA在叮咬部位拦截病毒粒子，而在于黏膜免疫能够有效启动MALT内的抗原特异性B和T淋巴细胞，这些细胞随后在系统中循环并有助于外周免疫的建立。研究还表明，黏膜疫苗接种可以建立强效的系统免疫记忆，并产生高滴度的循环IgG和效应T细胞，能够对外周抗原暴露做出快速反应。黏膜免疫的这个系统分支对登革热尤其相关，因为病理发生在肝脏、脾脏和内皮，而不是黏膜表面。最近的临床研究表明，NS1特异性抗体虽然在经典途径中不中和病毒，但通过参与Fc依赖性效应机制（如抗体依赖性细胞毒性（ADCC））介导保护。Sanchez-Vargas等人（142）表明，NS1导向抗体可以募集自然杀伤（NK）细胞裂解感染的靶细胞，从而减少病毒载量并减轻严重的登革热后果。
其他临床前研究也显示了有前景的结果，证明DENV抗原的黏膜递送可以诱导黏膜IgA和系统IgG反应，以及强大的T细胞激活。例如，通过基因E激活裂解的鼠伤寒沙门氏菌被设计用于使用表达载体pJHL184递送所有四种DENV血清型的包膜蛋白域III（EDIII）。与未免疫对照组相比，用重组沙门氏菌空壳免疫的小鼠显示出EDIII特异性IgG、IgG1和IgG2a（p < 0.01）滴度显著升高，以及淋巴细胞增殖活性和CD3⁺ CD4⁺ T细胞亚群增加。类似地，一种基于纳米乳剂的口服疫苗，旨在递送重组四价DENV抗原，能够诱导先天和适应性免疫反应。免疫小鼠表现出强大的抗原特异性体液和细胞反应，特点是IgG1、IgG2a和IgA滴度升高，IFN-γ和IL-4水平高，以及CD8⁺ T细胞频率增加。在登革热背景下，目前尚无针对黏膜疫苗的临床证据，因为没有许可的口服或鼻内登革热疫苗进入人体试验。尽管如此，已建立的黏膜平台，如口服脊髓灰质炎疫苗和鼻内流感疫苗，提供了概念验证，即黏膜途径可以诱导具有临床效力的黏膜和系统免疫反应。与此相辅相成的是，通过非肠道途径递送的基于NS1的登革热候选疫苗已显示，循环抗体和T细胞在临床前模型中赋予针对病毒血症和NS1介导的血管渗漏的保护。因此，通过拓宽免疫激活和加强限制病毒复制的系统反应，以及效应T细胞功能杀死感染细胞，从而在皮肤接种后不久拦截DENV，黏膜疫苗接种在机制上仍然相关。值得注意的是，早期研究表明，用表达登革热抗原的食品级酵母进行口服免疫诱导了系统登革热特异性IgG和黏膜分泌型IgA。在另一个例子中，用植物基登革热抗原tEDIII-Co1口服免疫的动物，即使在无佐剂的情况下也表现出强大的抗原特异性B细胞和T细胞反应。

7. 细菌孢子作为黏膜疫苗递送平台
革兰氏阳性、形成孢子的细菌，特别是枯草芽孢杆菌，已成为强大的表达系统和创新的疫苗递送载体。这些微生物因其非致病性以及在工业和食品及益生菌应用中的既定安全特性，被监管机构（包括美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲食品安全局（EFSA））归类为“一般认为安全”（GRAS）。它们独特的组合特性，包括极端环境稳定性（包括胃酸耐受性）同时保持表面展示抗原的完整性、异源抗原呈递能力以及固有免疫原性，使其成为下一代疫苗平台的有前景的候选者。
细菌孢子的韧性源于其在营养耗尽生长条件下启动的孢子形成过程中形成的复杂多层结构。这种转化产生了代谢休眠的孢子，能够承受极端条件，包括湿热（121°C 15分钟）、干燥、紫外线（UV）辐射和化学消毒剂。其结构包含一个由小酸溶性孢子蛋白（SASPs）和吡啶二羧酸（DPA）稳定的DNA核心、一个低渗透性的内膜、一个由交联肽聚糖组成的厚皮层，以及一个由超过70种不同蛋白质组成的蛋白质外壳。这些生物物理特性为疫苗应用提供了几个优势。孢子的稳定性，包括抵抗胃酸（pH 1.5-3）、胆汁盐（0.3-2%）和长期干燥，促进了潜在的口服递送，免除了对冷链基础设施的需求，从而解决了低收入和中等收入国家（LMICs）全球疫苗分发中的一个主要后勤障碍。摄入后，孢子被肠道相关淋巴组织（GALT）中派尔集合淋巴结的M细胞摄取，促进抗原摄取和免疫系统启动。孢子在肠腔内的萌发促进了抗原的逐渐释放，从而延长了免疫系统暴露时间，并可能减少多次加强剂量的需求。虽然黏膜相互作用触发分泌型IgA（成功免疫的关键生物标志物）的产生，但它也同时调动系统免疫。通过激活T和B淋巴细胞，这一过程产生循环IgG抗体并建立长期免疫记忆。这种药代动力学特征不同于非肠道疫苗，后者抗原直接递送到系统组织并被局部抗原呈递细胞（APCs）有效捕获。这些APCs加工抗原并将其呈递给MHC I类和II类复合物，导致体液和细胞免疫反应的激活。这产生的免疫主要是系统性的，有效产生效应和记忆淋巴细胞，提供针对播散性感染的保护。因此，非肠道疫苗接种主要驱动快速的系统免疫诱导，但缺乏跨多个免疫区室的持续抗原暴露。
针对非登革热病原体的基于孢子的疫苗的临床前研究证明，口服给药后有效诱导了抗原特异性CD4⁺和CD8⁺ T细胞反应以及黏膜和系统免疫反应。黏膜和系统免疫的这种双重刺激突出了基于细菌孢子的平台的多功能性，尽管系统反应对登革热仍然特别关键。此外，细菌孢子还表现出内在佐剂特性，孢子外壳成分和萌发衍生分子刺激模式识别受体，包括Toll样受体（TLRs）2和4，触发树突状细胞成熟和巨噬细胞激活。这些先天免疫反应有利于Th1/Th17极化的适应性反应的发展，这对细胞内病原体特别有效。
细菌孢子表面可以通过与孢子外壳蛋白（包括但不限于CotB、CotC、CotG和CotZ）的基因融合来设计用于抗原呈递。这是通过孢子形成期间母细胞中的重组表达、染色体整合，或基于疏水或静电相互作用的孢子与稳定表面结合抗原的被动吸附来实现的。基于这些方法，后续研究表明，抗原定位到孢子表面可以不依赖于Cot蛋白融合实现，从而简化了菌株构建并扩展了基于孢子的疫苗平台的通用性。临床前研究已证明了基于孢子的疫苗针对多种病原体靶点的效力。表达炭疽杆菌保护性抗原的重组孢子诱导的中和抗体水平与常规炭疽疫苗相当。最近，被工程化以表达SARS-CoV-2刺突蛋白和受体结合域（RBD）的枯草芽孢杆菌孢子被证明能引发适应性免疫反应，并显著增加小鼠和人类志愿者中的中和抗体。展示鲍曼不动杆菌TonB依赖性受体（TBDRs）的枯草芽孢杆菌孢子，在口服给药后，在肠道黏膜和血清中引发了强大的抗原特异性免疫反应。这些基于细菌孢子的疫苗具有高热稳定性的特点，冻干的孢子在25°C下可保持其活力和免疫原性长达12个月。
尽管枯草芽孢杆菌孢子已被广泛探索作为各种抗原的黏膜递送载体，但目前没有登革热特异性功能数据证明NS1-孢子构建体在临床前模型中的应用。未来的研究应侧重于验证基于孢子的NS1构建体在登革热动物模型中的效果，特别是在T细胞功能、组织特异性病毒控制以及与现有NS1平台的比较性能方面。然而，概念验证证据支持口服NS1疫苗接种的可行性。Liu等人（153）报道，一种由非肠道NS1免疫随后口服表达NS1的沙门氏菌加强（以两性霉素B作为免疫增强剂）组成的方案，显著提高了体液和细胞免疫水平。这一发现突显了肠道启动增强和先天免疫激活在改善NS1靶向疫苗免疫原性和赋予针对DENV保护方面的潜力。口服表达NS1的重组枯草芽孢杆菌孢子可以刺激黏膜树突状细胞和M细胞，导致黏膜归巢T细胞的启动和随后的系统CTL反应的激活。虽然DENV最初在皮肤驻留免疫细胞中复制，黏膜疫苗接种通过拓宽系统免疫提供了战略优势，从而限制了病毒传播。诱导黏膜和系统T细胞免疫的能力使基于孢子的疫苗成为不仅用于感染控制，也用于减轻疾病严重程度的强大策略。因此，GRAS认证的枯草芽孢杆菌孢子代表了安全性、生物耐久性、免疫学通用性和递送灵活性的融合。它们引发黏膜和系统免疫的能力，加上热稳定性和灵活的抗原呈递策略，使其成为疫苗开发的一个有前景的平台。此外，在登革热预防中，黏膜疫苗可能比非肠道疫苗提供几个优势，包括无针、更易给药以及便于重复给药，这可能提高患者接种意愿，特别是在登革热流行地区。

8. 未来展望与挑战
尽管基于孢子的登革热疫苗开发，特别是那些靶向NS1的疫苗，取得了有前景的进展，但其临床转化仍存在几个挑战。DENV NS1通过多种机制（包括补体激活和内皮破坏）导致严重登革热病理学和血管渗漏。因此，NS1本身可能构成加剧登革热严重程度的潜在威胁。除了通过去除NS1有害的羧基端来截短NS1的策略外，将NS1表达在孢子表面进行递送的方法将减轻潜在的病理效应，因为该蛋白不会直接与内皮相互作用，也不会激活补体途径。然而，据报道，基于NS1的口服候选疫苗能引发介导Fc依赖性效应功能（如ADCC）的抗体，并诱导功能性细胞介导的免疫，这将促进感染细胞的杀伤。总的来说，这些发现支持将NS1整合到基于孢子的黏膜平台中，作为利用保护性免疫同时减轻NS1相关病理学的手段。然而，一个主要障碍是优化孢子外壳上或内部的抗原表达，以确保一致的免疫原性而不损害孢子的稳定性。虽然枯草芽孢杆菌孢子本身是安全且强健的，但在良好生产规范（GMP）条件下进行规模化生产仍未得到充分探索。这一局限性主要是由于需要工业规模的孢子形成，这通常会导致孢子群体异质性、重组产量可变以及批次间疫苗效力可能不一致。因此，下游处理，包括纯化和抗原表达验证，对于标准化最终制剂变得必不可少。然而，相对于常规亚单位或灭活疫苗平台，这些过程引入了额外的复杂性。另一方面，虽然非肠道疫苗需要极其纯化的抗原，口服基于孢子的疫苗可以在不需要近乎完全纯的重组孢子的情况下保持免疫活性，因为它们可能需要更简单的生产系统，不需要额外的纯化步骤。这是因为即使抗原表达仅限于20-30%的重组孢子亚群，也已观察到有效的黏膜和系统免疫反应。
除此之外，缺乏标准化的基于孢子的疫苗质量对照测定进一步复杂化了其临床转化。因此，开发验证重组孢子比例和孢子活力的测定方法，对于确保产品一致性和符合监管要求将非常有价值。虽然生产一致性和质量控制仍然是重大障碍，但缺乏明确的基于孢子的疫苗监管框架对其临床转化构成了同样关键的障碍。这种模糊性源于其混合生物学性质。被工程化以表达抗原的重组枯草芽孢杆菌孢子不符合现有的食品、益生菌或生物疫苗类别。尽管枯草芽孢杆菌被美国食品药品监督管理局归类为“一般认为安全”（GRAS）可供食用，但其重组衍生物构成了具有免疫学功能的基因改造生物制品，因此超出了食品级法规的范围。然而，严格将其归类为疫苗，忽视了其口服递送和食品兼容的特性。这种监管差距凸显了可能需要一个中间分类，也许称为“食品级疫苗”或“口服生物治疗剂”，以反映其作为具有明确免疫功能