《Regional Studies in Marine Science》：Brain Transcriptomic Signatures Underlying Sex Differentiation in the Protandrous Hermaphrodite Eleutheronema tetradactylum
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埃沃迪娅·摩西斯·姆库洛|本顺·苗|卢克曼·伊德里斯苏|弗雷德·比西赫|李静|夸库·阿莫阿|黄建生|王贝|王忠良•四指丝鳍鱼雄先熟的脑部结构控制着性别转换。•228个差异表达基因及关键信号通路（MAPK、类固醇合成途径）决定了鱼的性别差异。•在四指丝鳍鱼中发现了8个新的与性别相关
埃沃迪娅·摩西斯·姆库洛|本顺·苗|卢克曼·伊德里斯苏|弗雷德·比西赫|李静|夸库·阿莫阿|黄建生|王贝|王忠良
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四指丝鳍鱼雄先熟的脑部结构控制着性别转换。
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228个差异表达基因及关键信号通路（MAPK、类固醇合成途径）决定了鱼的性别差异。
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在四指丝鳍鱼中发现了8个新的与性别相关的差异表达基因并得到了验证。
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神经可塑性、激素调控以及应激反应推动了关于两性同体现象的研究。
引言
作为最具适应能力和多样性的脊椎动物之一，鱼类被用作研究大脑性别分化机制的重要模型（Zhai等人，2022）。在真骨鱼类中，生殖过程由脑-垂体-性腺轴调控，该轴负责调节神经内分泌相互作用（Nagahama等人，2021）。这一轴通过一系列神经激素将环境和内部刺激转化为行动，这些激素包括亲吻肽（Degani，2020）、生长激素（Vahira，2020）、促性腺激素释放激素（Vissio等人，2021）、催乳素（Shen等人，2021）、生长抑素（Fukamachi等人，2005），此外还有与应激适应相关的激素，它们都参与了大脑如何解读特定性别的神经回路并进而影响生殖表型（Casta?eda-Cortés和Fernandino，2021；Kitano等人，2022）。在真骨鱼类中，下丘脑中的促性腺激素释放激素会刺激垂体的腺垂体促性腺细胞释放卵泡刺激素和黄体生成素，这两种激素能促使雌雄鱼类都产生类固醇和生殖细胞（Celino-Brady等人，2022）。这一复杂的激素级联反应是由参与性腺发育的基因网络通过上调或下调来控制的。然而，大多数研究都集中在单个分子途径上，而关于大脑在性别分化中所起作用的系统研究则相对较少（Shahi等人，2023）。已有多项研究探讨了不同鱼类物种中与性别特征及生殖相关的基因表达模式，研究对象包括金马鲛（Shahi等人，2023）、小丑鱼（Casas等人，2016）、蓝孔雀鱼（Degani和Meerson，2024）、双带海龙（Liu等人，2015）、斑马鱼（Degani和Meerson，2024）、金番鱼（Sun等人，2023）、欧洲海鲈（Alvarado等人，2013）、虹鳟鱼（Xu等人，2016）、欧洲鳗鱼（Churcher等人，2014）以及乌苏里鲶鱼（Pan等人，2021）。
迄今为止，还尚未有研究分析过四指丝鳍鱼脑组织中与性腺分化、发育及生殖相关的基因的RNA转录本表达水平。这种通常被称为四指丝鳍鱼的鱼类属于多鳍鱼科的一种广盐性真骨鱼类，具有雄先熟的两性同体特性，会在其生命周期中出现性别转换（Soe等人，2023）。对小丑鱼的研究表明，在性别转换过程中，大脑、行为以及性腺中的雌性组织功能和发展过程会发生可逆的抑制，这一现象体现了两性同体形成过程中复杂的神经内分泌变化（Casas等人，2022；Parker等人，2024）。与小丑鱼不同，四指丝鳍鱼没有社会结构或群体繁殖行为；不过雌性鱼的发育阶段更为成熟，身体和生殖方面的投入也更多，这或许就是为什么在我们的研究中雌性鱼脑组织的转录组活动明显高于雄性鱼的原因。四指丝鳍鱼广泛分布于印度-西太平洋地区，它在提供食物和娱乐休闲方面具有重要的生态价值（Xuan和Wang，2023）。由于其能够适应不同的盐度环境，再加上独特的生殖生物学特性，它成为了研究发育与适应、性别分化以及神经差异性的整合组学研究的重要模型（Hung等人，2022）。然而，由于目前缺乏有效的圈养繁殖技术，该物种在水产养殖领域的应用前景仍然受限。因此，了解与性别特异性神经分化相关的分子机制和路径对于水产养殖的发展至关重要（Capel，2017）。
RNA测序技术的最新进展揭示了显著的性别特异性转录组差异，为理解真骨鱼类的脑部分化提供了新的见解（Zhai等人，2022）。然而，四指丝鳍鱼的脑转录组至今仍未被研究。为填补这一空白，我们对成年雄性和雌性四指丝鳍鱼的全脑样本进行了RNA测序。我们的研究包括了全面的生物信息学分析、功能注释以及表达分析。其中一些候选基因的差异表达通过定量实时PCR技术得到了验证（Haas等人，2013）。本研究首次对四指丝鳍鱼脑部中存在性别偏好的基因表达进行了比较转录组分析，确定了潜在调控网络的候选基因和信号通路。通过建立这一分子框架，我们的研究结果为理解脊椎动物性别发育过程中的神经可塑性奠定了基础，这有望为提升该物种的水产养殖价值提供依据。
章节要点
四指丝鳍鱼采样流程
我们从中国广东省的广东河泰渔业科技有限公司获得了性成熟的四指丝鳍鱼种源。我们用浓度为10毫克/升的甲磺酸三甲胺苯酯（MS-222，Sigma Aldrich）对6只成年鱼（3只雄性，3只雌性）进行麻醉，以尽量减少其受到的压力。我们从每条鱼身上取出整个脑组织，立即在液氮中冷冻，然后储存在-80℃条件下，为后续的RNA提取做准备。这些样本被分别标记为FB-1、FB-2、FB-3（雌性鱼的脑组织），以及MB-1、MB-2、MB-3
体型上的性别差异
这6只成年四指丝鳍鱼（雌雄各3只）表现出明显的性别差异。处于雌性阶段的鱼体型远大于处于雄性阶段的鱼，这种性别差异相当显著。雄性鱼的平均体长和体重分别为35.0±0.20厘米和175.0±2.10克，而雌性鱼的平均体长和体重则为40.25±0.45厘米和320.5±3.52克。只有雌性鱼的体型更大，这种情况符合预期
雄先熟两性同体鱼的性别偏好脑转录组
对于具有重要经济价值的鱼类物种而言，研究其性别分化及成熟过程是一个非常有趣的课题（Budd等人，2015）。大脑在生殖生理过程中起着重要作用（Okubo等人，2019），并且会经历显著的性别特异性分化，这种分化会影响神经回路及其功能（Genario等人，2020；Zelco等人，2023）。在雄先熟的两性同体鱼四指丝鳍鱼中，我们发现了脑转录组存在明显的性别差异。我们
结论与未来展望
本研究首次对雄先熟的两性同体鱼四指丝鳍鱼的脑转录组进行了比较分析，为理解性别分化背后的转录机制提供了重要的分子层面的见解。我们发现存在明显的雌性偏好型转录特征，这说明大脑在雌性阶段处于一种独特的分子状态。我们的系统级分析还揭示了一些功能上存在差异的信号通路：这些差异十分显著
伦理声明
在广东海洋大学进行的这项动物实验已经获得了机构动物伦理与使用委员会的批准，批准编号为GDOU-LAE-2023-015，批准日期为2023年4月4日，该批准确保了实验的开展是以保障鱼类福利为原则的。同时，我们也获得了鱼类所有者的书面同意，这体现了我们对他们权益的尊重。
CRediT作者贡献说明
卢克曼·伊德里斯苏：写作——审阅与编辑、可视化、正式分析、数据整理、概念构建。弗雷德·比西赫：写作——审阅与编辑、可视化、软件使用、研究实施。李静：可视化、软件使用、研究实施。夸库·阿莫阿：写作——审阅与编辑、可视化、监督、方法设计、研究实施、正式分析、数据整理、概念构建。埃沃迪娅·摩西斯·姆库洛：写作——初稿撰写、可视化、软件使用、方法设计、研究实施、正式分析
利益冲突声明
作者声明自己不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了广东省普通高等学校重点领域专项项目（农村振兴科技服务项目）（2023ZDZX4011）、广东省现代海洋牧业候选品种繁育技术研究项目（2024-MRB-00-001），以及广东省普通高等学校创新团队项目（2021KCXTD026；2022KCXTD013）的资助。
