衰老巨噬细胞中FASN介导的脂肪生成上调促进肝纤维化进展

《Frontiers in Immunology》：Upregulated FASN-mediated lipogenesis in senescent macrophages contributes to liver fibrosis progression

　　

背景：肝纤维化（liver fibrosis）是多种慢性肝病常见的晚期病理阶段。巨噬细胞（macrophages）作为先天免疫的关键调节因子，在肝纤维化发展中发挥重要作用。细胞衰老（cellular senescence）是一种不可逆的细胞周期停滞状态。然而，衰老巨噬细胞在肝纤维化中作用的机制尚不完全清楚。方法：通过腹腔注射25%四氯化碳（CCl₄）在年轻（8周）和中年（12月龄）小鼠中诱导肝纤维化。研究人员使用组织病理学、血清生化、Western blotting、RT-qPCR、免疫组织化学和免疫荧光评估肝功能和免疫微环境。通过暴露于H₂O₂在RAW264.7细胞中建立了衰老巨噬细胞模型。将衰老巨噬细胞的条件培养基转移到LX-2细胞中，以评估肝星状细胞（HSC）的活化。对衰老的RAW264.7细胞进行转录组测序以确定潜在机制。使用放线菌酮（CHX）追踪实验检测FASN蛋白稳定性，并通过MG132和氯喹（CQ）联合处理初步探索降解途径。结果：在体内，接受CCl₄处理的中年小鼠比年轻小鼠表现出更严重的肝脏胶原沉积、纤维化和衰老。在体外，衰老巨噬细胞中SASP（senescence-associated secretory phenotype）成分（包括促炎细胞因子和趋化因子）以及DNA损伤标志物的表达上调，其条件培养基促进LX-2细胞活化。衰老RAW264.7细胞的转录组测序揭示了一种双向脂肪酸代谢重编程，其特征为参与脂肪酸β-氧化的基因下调，而参与脂肪酸合成的基因上调。此外，研究人员发现FASN蛋白通过泛素-蛋白酶体和自噬途径发生双重降解。而且，药理学抑制FASN减弱了衰老巨噬细胞中的DNA损伤反应。结论：中年纤维化肝脏中的巨噬细胞表现出细胞衰老。FASN介导的脂肪酸合成增强导致衰老巨噬细胞中脂质代谢紊乱和积累。这些衰老巨噬细胞促进HSC活化并驱动肝纤维化进展。

### 论文解读：衰老巨噬细胞中FASN介导的脂肪生成上调促进肝纤维化进展

#### 研究背景与问题
肝纤维化是多种慢性肝病（如病毒感染、酒精滥用、药物毒性）的共同晚期病理阶段，全球每年约200万人因此死亡。其病理核心是肝内细胞外基质（ECM）过度沉积和结构紊乱，最终可进展为肝硬化甚至肝细胞癌。巨噬细胞作为先天免疫的关键调节因子，在肝纤维化发展中通过释放细胞因子、激活肝星状细胞（HSC）等途径发挥双向调控作用。细胞衰老是一种不可逆的细胞周期停滞状态，可由DNA损伤、氧化应激、衰老等多种因素触发，衰老细胞通过分泌衰老相关分泌表型（SASP）影响邻近细胞。尽管已有研究在肝细胞和HSC中观察到衰老现象，但衰老巨噬细胞在肝纤维化中的具体作用及其机制尚不完全清楚。特别是，免疫衰老已被证实可诱导系统性衰老和组织衰老，但巨噬细胞衰老对肝纤维化进展的影响及代谢调控机制缺乏深入探索。因此，阐明衰老巨噬细胞在肝纤维化中的角色及其潜在分子机制，对于开发靶向治疗策略具有重要意义。

#### 研究内容与结论
研究人员通过体内外实验系统揭示了衰老巨噬细胞在肝纤维化进展中的作用及代谢调控机制。在体内，使用C57BL/6小鼠（年轻8周龄，中年12月龄）通过腹腔注射CCl₄建立肝纤维化模型，发现中年小鼠较年轻小鼠表现出更严重的肝脏胶原沉积、纤维化及细胞衰老。免疫荧光和免疫组化证实，纤维化肝脏中的巨噬细胞（F4/80⁺）显著表达衰老标志物（p21、γH2AX、53BP1）且Laminb1表达降低，且中年小鼠中p21⁺F4/80⁺巨噬细胞比例更高。在人类肝纤维化S3期标本中同样观察到p21⁺CD68⁺巨噬细胞比例增加。在体外，通过H₂O₂处理RAW264.7巨噬细胞建立衰老模型，证实衰老巨噬细胞SASP成分（IL-1β、TNF-α等）和DNA损伤标志物（γH2AX、53BP1）上调，且其条件培养基可促进LX-2人肝星状细胞活化（α-SMA和COL1A1表达升高）。转录组测序揭示衰老巨噬细胞发生双向脂肪酸代谢重编程：脂肪酸β-氧化基因（Cpt1a、Cpt2、Cd36、Acaca等）下调，而脂肪酸合成基因（Fasn、Fabp4、Scd4、Dgat2）上调，导致脂滴积累。进一步研究发现，FASN蛋白通过泛素-蛋白酶体和自噬途径双重降解，而药理学抑制FASN（使用TVB-2640、GSK2194069、C75）可减弱衰老巨噬细胞中p21、γH2AX表达及p53磷酸化，表明FASN是维持衰老表型的关键驱动因子。该研究发表在《Frontiers in Immunology》。

#### 主要关键技术方法
研究人员采用CCl₄腹腔注射对年轻（8周龄）和中年（12月龄）C57BL/6雄性小鼠（来源：上海模式生物中心）诱导肝纤维化模型，共8周。通过组织病理学（H&E、Masson三色、Sirius Red染色）、血清生化（ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL、γ-GT）、Western blotting、RT-qPCR、免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）评估肝功能和免疫微环境。在RAW264.7细胞中，以200 μmol/L H₂O₂处理2小时建立衰老模型，并通过SA-β-Gal染色、p21/γH2AX免疫荧光验证。使用衰老巨噬细胞的条件培养基（CM）处理LX-2细胞（人肝星状细胞）进行间接共培养，检测HSC活化标志物。对衰老RAW264.7细胞进行转录组测序（NovelBio Bio-Pharm Technology Co., Ltd.），结合GO、KEGG和GSEA分析。采用放线菌酮（CHX）追踪实验检测FASN蛋白稳定性，并使用MG132（蛋白酶体抑制剂）和氯喹（CQ，自噬抑制剂）联合处理探索降解途径。此外，应用三种FASN抑制剂（TVB-2640、GSK2194069、C75）处理衰老巨噬细胞，评估对衰老表型的影响。人类肝组织标本来自南京第二医院肝病治疗中心（2023年11月至2025年11月），包括6例肝炎和6例肝纤维化S3期患者，经皮肝活检获取。

#### 研究结果

**3.1 细胞衰老存在于肝纤维化小鼠模型中**
通过CCl₄诱导年轻和中年小鼠肝纤维化，中年小鼠体重下降更显著，血清ALT、AST、ALP水平更高（P<0.001）。组织学显示中年CCl₄组炎症细胞浸润、胶原沉积（Masson和Sirius Red染色）及SA-β-Gal阳性染色均显著高于年轻CCl₄组。Western blotting证实中年CCl₄组p21、p53、γH2AX、α-SMA蛋白水平进一步升高（P<0.001），表明衰老与纤维化随年龄加重。

**3.2 巨噬细胞在CCl₄诱导的肝纤维化中发生细胞衰老**
免疫组化显示p21和γH2AX在纤维化肝组织中阳性，中年组更强。免疫荧光共染发现，年轻CCl₄组F4/80⁺巨噬细胞中53BP1 foci增加、Laminb1减少；中年CCl₄组p21⁺F4/80⁺共定位比例显著高于年轻CCl₄组（P<0.001）。人类肝纤维化S3期标本中p21⁺CD68⁺细胞比例也显著升高（P<0.001），证实巨噬细胞在纤维化肝脏中呈现衰老表型。

**3.3 在RAW264.7小鼠单核巨噬细胞中建立衰老模型**
通过CCK-8确定H₂O₂ IC50为217.26 μmol/L，选用200 μmol/L处理2小时。SA-β-Gal染色、p21/γH2AX免疫荧光、RT-qPCR（p21、Rage、SASP因子等上调，H2ax、Hdac1、Hmgb1下调）及Western blotting（p19、p21、γH2AX、53BP1、IL-1β、TNF-α上调，p-p53/p53升高，p-RB/RB降低）均证实衰老模型建立成功，且迁移能力下降。

**3.4 衰老RAW264.7巨噬细胞促进肝星状细胞LX-2活化**
使用衰老RAW264.7的条件培养基（CM）处理LX-2细胞，RT-qPCR和Western blotting均显示α-SMA和COL1A1 mRNA及蛋白水平显著升高（P<0.05），表明衰老巨噬细胞通过旁分泌途径激活HSC。

**3.5 转录组学揭示衰老巨噬细胞中衰老相关特征和脂肪酸代谢重编程**
转录组测序鉴定出1,477个差异表达基因（DEGs，上调1,062，下调415）。衰老巨噬细胞中活化标志物（Ntn3、Cxcr4等）、衰老标志物（Cdkn1a、Sqstm1等）及脂肪酸合成和脂质储存基因（Fabp4、Scd4、Dgat2）上调；而部分SASP趋化因子（Ccl2、Cxcl10）及脂肪酸β-氧化关键基因（Cd36、Acaca、Cpt2）下调。GO和KEGG富集分析显示DEGs富集于细胞周期、DNA损伤、铁死亡、糖酵解、p53和NF-κB通路。GSEA进一步证实脂肪酸代谢、MAPK、FAK等通路显著富集。

**3.6 衰老巨噬细胞通过脂肪酸代谢重编程维持衰老表型和SASP分泌**
RT-qPCR证实β-氧化关键酶Cpt1a、Cpt2及上游调控因子Acaca、Pparα、Pparδ、Pparγ、Cd36、Prkdc表达降低（P<0.05）。Western blotting显示FASN、HDAC2、p38蛋白上调，而CPT2、ACACA、PPARδ、PPARγ下调（P<0.001）。BODIPY 493/503染色显示衰老巨噬细胞脂滴积累显著增加（P<0.001），证实脂肪酸合成增强、β-氧化抑制导致脂质积累。

**3.7 FASN蛋白通过泛素化和自噬途径降解，抑制FASN减弱细胞衰老表型**
CHX追踪实验显示FASN蛋白随时间逐渐降解。MG132或CQ处理可延缓CHX诱导的FASN降解，表明两种途径均参与。三种FASN抑制剂（TVB-2640、GSK2194069、C75）均显著降低衰老巨噬细胞中p21、γH2AX表达及p-p53/p53比值（P<0.05），其中C75还降低FASN蛋白水平，可能与其抑制SREBP-1通路和结构相似性有关。结论：FASN是维持衰老表型的关键驱动因子。

#### 讨论与结论
研究人员发现，在CCl₄诱导的肝纤维化模型中，中年小鼠较年轻小鼠表现出更显著的衰老和纤维化特征，且巨噬细胞获得衰老表型，尤其在中年小鼠中比例更高。这些衰老巨噬细胞通过SASP成分促进HSC活化，并表现出脂肪酸代谢重编程：脂肪酸合成增强、β-氧化抑制，导致脂滴积累。FASN蛋白通过泛素-蛋白酶体和自噬途径双重降解，药理学抑制FASN可减弱衰老表型。研究局限性包括：临床样本数量有限、未使用≥18月龄的老年小鼠、未进行FASN基因敲除或过表达以验证因果机制。尽管如此，该研究揭示了巨噬细胞衰老在肝纤维化中的代谢维度，为靶向FASN治疗肝纤维化提供了潜在靶点。结论：第一，巨噬细胞衰老是中老年纤维化肝脏的突出特征，中年CCl₄处理小鼠中衰老标志物和SASP成分表达加剧；第二，衰老巨噬细胞通过促进HSC活化驱动肝纤维化进展；第三，脂肪酸代谢重编程（FASN上调、β-氧化抑制）是关键机制，维持衰老表型和促纤维化活性。综上，FASN是巨噬细胞衰老的关键驱动因子，为肝纤维化提供了潜在治疗靶点。