几丁质(chitin)介导的NLRP3炎症小体(NLRP3 inflammasome)活化受损是导致裴氏丰萨卡菌(Fonsecaea pedrosoi) muriform细胞所致难治性着色芽生菌病(chromoblastomycosis)的根本原因

《Frontiers in Immunology》：Impaired NLRP3 inflammasome activation by chitin underlies refractory chromoblastomycosis caused by Fonsecaea pedrosoi muriform cells

　　

引言：巨噬细胞NLRP3活化对抗真菌免疫至关重要，但其在着色芽生菌病(chromoblastomyi-cosis)——一种通常由裴氏丰萨卡菌(Fonsecaea pedrosoi)引起的慢性皮下真菌病中的作用仍不明确。与先前使用分生孢子(conidia)和菌丝(hyphae)的自限性模型不同，临床疾病以muriform细胞为特征，这是一种抵抗巨噬细胞且与会慢性性相关的寄生形态。值得注意的是，几丁质(chitin)作为一种弱的NLRP3激动剂，在muriform细胞表面累积。本研究探讨几丁质累积是否调节NLRP3活化并促进真菌持续存在。方法：研究人员通过免疫组化(IHC)（MPO、CD86、NLRP3）和RT-PCR分析人着色芽生菌病病变中的细胞因子转录本。将WT和NLRP3–/–小鼠足垫接种裴氏丰萨卡菌(F. pedrosoi) muriform细胞进行体内评估。流式细胞术微球阵列(flow cytometric bead array)定量测定足垫匀浆中的IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α和IL-17A，以及刺激的小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDM)上清液中相同面板（排除IL-17A）的细胞因子。通过蛋白质印迹(western blotting)和免疫荧光确认BMDMs中NLRP3通路活化。结果：在人病变中，显著的MPO+中性粒细胞招募包裹muriform细胞，然而多核巨细胞将部分真菌成分与中性粒细胞隔离。尽管与正常皮肤相比NLRP3表达强劲且IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10升高（均p < 0.01），muriform细胞仍在组织中持续存在。在WT小鼠中，病变从化脓性（第7天）转变为肉芽肿性（第90天），同时IL-1β、IL-17A、IL-6和TNF-α下降。第7天MPO+中性粒细胞大量包围muriform细胞；第90天，F4/80+巨噬细胞包裹大多数真菌但未能清除，形成多核巨细胞——重现人类病理。在NLRP3–/–小鼠中，IL-1β和IL-17A以NLRP3非依赖方式产生且随时间无下降。Muri-form细胞在巨细胞内外的芽生并逐渐转变为菌丝；MPO+中性粒细胞优先定位于菌丝区域，而巨噬细胞留在muriform细胞周围，提示区室化炎症。体外实验中，经壳聚糖酶(chitinase)处理的muriform细胞在WT BMDMs中诱导比完整细胞更高的NLRP3依赖性IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10（均p < 0.01）。机制上，几丁质累积部分抑制NF-κB磷酸化，降低NLRP3表达、caspase-1剪切和ASC斑点(speck)形成。结论：NLRP3介导针对muriform细胞的宿主防御但未能解决慢性感染。Muri-form细胞上的几丁质累积减弱NLRP3活化，从而促进着色芽生菌病的慢性化。

该研究发表于《Frontiers in Immunology》。研究背景方面，着色芽生菌病(chromoblastomycosis, CBM)是由嗜角质性暗色真菌（主要为裴氏丰萨卡菌Fonsecaea pedrosoi）引起的慢性进行性皮下真菌病，临床表现为疣状增生，易恶变为鳞状细胞癌且抗真菌疗效不佳。在组织病理中，病原体呈现为深棕色、肿胀、厚壁的muriform细胞（亦称硬化体或Medlar小体），其抵抗巨噬细胞吞噬并长期存活于多核巨细胞内，是CBM慢性化的标志。既往研究表明，真菌细胞壁的β-葡聚糖(β-glucan)和α-甘露糖(α-mannan)可通过模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)激活NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3)-ASC-Caspase-1炎症信号通路产生IL-1β等细胞因子发挥防御作用，而几丁质(chitin)作为真菌骨架主要成分仅微弱激活NLRP3。研究人员前期发现裴氏丰萨卡菌从腐生菌丝向寄生性muriform细胞形态转变过程中，几丁质特异性累积于muriform细胞表面，因此假设muriform细胞通过“几丁质累积效应”主动抑制NLRP3炎症小体活化及M1型巨噬细胞细胞因子分泌，导致CBM难治性。本研究旨在阐明muriform细胞逃避免疫清除的机制，探究几丁质累积对NLRP3通路的调控及其在CBM慢性化中的作用。

研究人员开展的研究通过建立临床组织分析、小鼠体内感染模型及体外细胞实验，证实NLRP3介导对muriform细胞的防御但不足以清除感染，muriform细胞表面几丁质累积削弱NLRP3活化是促进CBM慢性化的关键机制。结论指出NLRP3炎症小体(NLRP3 inflammasome)参与宿主防御裴氏丰萨卡菌(Fonsecaea pedrosoi) muriform细胞却无法解决慢性感染，muriform细胞上的几丁质(chitin)累积减弱NLRP3活化从而促进着色芽生菌病(chromoblastomycosis)慢性化。

主要关键技术方法包括：收集武汉第一医院皮肤科确诊的6例CBM患者皮损活检样本及6例正常皮肤对照进行免疫组化(IHC)与RT-qPCR；从WT及NLRP3^–/–C57BL/6n小鼠分离培养小鼠骨髓源性巨噬细胞(mBMDMs)；在ATCC 830培养基36°C条件下诱导裴氏丰萨卡菌WH10–002菌株由腐生菌丝转化为高纯度muriform细胞；对muriform细胞进行热灭活及壳聚糖酶(chitinase)处理去除表面几丁质；通过足垫注射muriform细胞建立WT与NLRP3^–/–小鼠CBM慢性感染模型，评估足垫肿胀、真菌负荷(CFU)及组织学变化；利用流式细胞术微球阵列(CBA)检测组织匀浆与细胞上清液细胞因子(IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α, IL-17A)；采用蛋白质印迹(western blotting)检测NF-κB磷酸化、NLRP3表达及caspase-1剪切，免疫荧光观察ASC斑点(speck)形成；使用FITC标记麦胚凝集素(FITC-conjugated WGA)染色验证几丁质分布。

研究结果如下：

3.1 Defective human macrophage killing and multinucleated giant cell formation sequester muriform cells from neutrophils, with robust NLRP3 expression and cytokine heterogeneity。研究人员通过对人CBM皮损HE及IHC染色发现，真皮及皮下混合炎细胞浸润形成微脓肿伴多核巨细胞，MPO⁺中性粒细胞包裹muriform细胞但被多核巨细胞部分隔离，CD68⁺巨噬细胞吞噬失败且胞内可见芽生muriform细胞；NLRP3在浸润炎细胞中高表达，RT-PCR显示CBM组织IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-10 mRNA水平显著高于正常皮肤（均p < 0.01），表明虽存在强烈NLRP3表达与炎症反应，巨噬细胞仍无法清除真菌。

3.2 In vitro induction efficiently converts saprophytic Fonsecaea pedrosoi into muriform cells at a high yield。研究人员在ATCC 830培养基36°C培养60天，使裴氏丰萨卡菌腐生菌丝转化为具横隔的棕褐色肿胀厚壁muriform细胞，过滤后纯度约85%，满足体内外实验需求。

3.3 Muriform cell inoculation induces chronic CBM in WT mice with human-like pathology。WT小鼠足垫接种muriform细胞后肿胀持续90天，早期（7天）化脓伴高真菌负荷(CFU)，后期（90天）转为肉芽肿伴负荷下降但未清零；组织学显示炎细胞从弥漫转为局灶浸润，muriform细胞被包裹于多核巨细胞内未被消除，复现人CBM病理特征。

3.4 NLRP3 deficiency exacerbates murine chromoblastomycosis and facilitates hyphal transition, histologically manifested as prominent macrophage accumulation in muriform-rich foci and robust neutrophil infiltration into hyphal regions。NLRP3^–/–小鼠足垫肿胀更重、真菌负荷(CFU)各时点均高于WT且持续高水平；45及90天可见muriform细胞内及细胞外芽生并转为菌丝(hyphae)；IHC示早期MPO⁺中性粒细胞包围muriform细胞，后期定位于菌丝区，F4/80⁺巨噬细胞仅聚集于muriform细胞区而无菌丝区聚集，提示NLRP3缺失加剧疾病并促进形态转换。

3.5 In WT mice, following the transition from a pyogenic to a chronic granulomatous pattern, the levels of pro-inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, IL-17A, and TNF-α) within the infectious foci showed a declining trend, whereas in NLRP3-deficient mice, these cytokines remained elevated in an NLRP3-independent manner。研究人员检测发现WT小鼠病灶IL-1β、IL-17A、IL-6、TNF-α随化脓向肉芽肿转变而下降；NLRP3^–/–小鼠各时点均可检出上述因子且无下降趋势，IL-1β与IL-17A在NLRP3缺失下仍以非依赖方式产生。

3.6 Chitin accumulation on muriform cells attenuates NLRP3-dependent IL-1β secretion and the broader cytokine response in mBMDMs。FITC-WGA染色证实几丁质富集于muriform细胞表面，壳聚糖酶(chitinase)处理后消失；完整muriform细胞仅诱导mBMDMs产生TNF-α，壳聚糖酶处理后显著升高WT与NLRP3^–/–mBMDMs的IL-6、IL-10、TNF-α（均p < 0.01），且WT中IL-1β显著升高而NLRP3^–/–中IL-1β极低，表明表面几丁质广泛抑制巨噬细胞细胞因子产生，IL-1β受NLRP3依赖性抑制。

3.7 Mechanistically, this chitin accumulation partly suppresses the NLRP3 priming and downstream signaling activation。蛋白质印迹显示完整muriform细胞轻度上调磷酸化NF-κB(p-NF-κB)/NF-κB及NLRP3、caspase-1剪切，壳聚糖酶处理后进一步显著增强（均p < 0.001）；免疫荧光示壳聚糖酶处理组ASC斑点(speck)形成显著增加，完整细胞组与对照组无差异，证实几丁质累积在启动（NF-κB磷酸化/NLRP3表达）及激活（ASC speck、caspase-1剪切）双层面抑制NLRP3炎症小体。

讨论部分总结：研究人员指出中性粒细胞通过ROS与NETosis对抗muriform细胞，但巨噬细胞融合为多核巨细胞隔离真菌使其避开通中性粒细胞杀伤，可能具致病性驱动慢性化。人病灶中NLRP3高表达及细胞因子上调仍无法清除真菌，与IL-10等免疫抑制相关。WT小鼠模型显示NLRP3抑制muriform细胞芽生与菌丝转换，维持肉芽肿表型；NLRP3^–/–中IL-1β/IL-17轴非依赖途径招募中性粒细胞清除菌丝但无法清除muriform细胞，致菌丝与muriform共存加重炎症。几丁质作为免疫惰性盾牌削弱NF-κB依赖性NLRP3启动及下游ASC speck与caspase-1活化，抑制IL-1β成熟释放及IL-6、TNF-α等分泌。研究存在人样本量少、muriform诱导含少量菌丝干扰、小鼠组织时点样本有限及体外短期培养难以完全模拟体内慢性微环境等局限，计划通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)进一步解析免疫动态。

研究结论部分翻译：NLRP3介导宿主防御对抗muriform细胞却未能解决慢性感染。几丁质(chitin)在muriform细胞上的累积减弱NLRP3炎症小体(NLRP3 inflammasome)的活化，从而促进着色芽生菌病(chromoblastomycosis)的慢性化。