《Frontiers in Immunology》：Anti-inflammatory CAR-microglia targeting Aβ for Alzheimer’s disease therapy
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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的特征是淀粉样蛋白-β(amyloid-β, Aβ)斑块积聚与慢性神经炎症共存，二者共同驱动进行性神经元丢失与认知功能衰退。近年来，靶向Aβ的单克隆抗体在AD治疗中显示出令人鼓舞的临床获益，但其疗效
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的特征是淀粉样蛋白-β(amyloid-β, Aβ)斑块积聚与慢性神经炎症共存，二者共同驱动进行性神经元丢失与认知功能衰退。近年来，靶向Aβ的单克隆抗体在AD治疗中显示出令人鼓舞的临床获益，但其疗效仍受限于Aβ清除不足且难以持续，以及治疗相关的神经炎症反应。这些局限性凸显了亟需能够在维持免疫稳态的同时实现高效Aβ清除的替代策略。为克服上述挑战，研究人员开发了一种新型抗炎症嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)-小胶质细胞(CAR-Mic)，其构建基于TAM受体家族(TYRO3、AXL和MERTK)，该家族是胞葬作用(efferocytosis)与抗炎症反应的关键调节因子。所得的靶向Aβ的CAR-Mics表现出增强的Aβ吞噬能力及降低的促炎细胞因子释放。在所测试的构建体中，AXL-CAR表现出最理想的综合性能，因此被选用于生成人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cell, iPSC)来源的CAR小胶质细胞样细胞(CAR-iMGLs)。在AD小鼠模型中，AXL-CAR-iMGLs表现出增强的Aβ清除能力，且无严重不良效应证据。综上，这些发现确立了基于TAM受体的CAR-iMGLs作为一种有前景的AD及其他以慢性神经炎症和病理性蛋白清除缺陷为特征的神经退行性疾病细胞治疗模型。
研究背景方面，阿尔茨海默病(AD)以淀粉样蛋白-β(Aβ)斑块进行性累积、神经原纤维缠结、慢性神经炎症、神经元功能障碍及神经退变为特征。当前靶向Aβ的单克隆抗体疗法虽取得一定临床进展，但主要依赖小胶质细胞上的Fc受体，常导致过度免疫激活与神经炎症，并诱发突触丢失与认知缺陷；同时AD患者小胶质细胞因遗传风险变异及长期炎症刺激，Aβ吞噬降解能力受损，限制了抗体疗法的持续有效性。过继转移小胶质细胞或髓系细胞虽可增强Aβ或Tau清除，但移植细胞易被AD脑内炎症微环境重塑为促炎表型，削弱长期疗效。工程化小胶质细胞表达嵌合抗原受体(CAR)可赋予确定的抗原特异性与可编程细胞内信号，然而能在中枢神经系统内同时支持高效Aβ吞噬与抗炎症能力的优化CAR架构尚未建立。TAM(TYRO3、AXL、MERTK)受体酪氨酸激酶家族是胞葬作用与免疫稳态的核心调节因子，其信号通过STAT1依赖的抑制因子(SOCS)蛋白表达广谱抑制细胞因子与Toll样受体通路，紧密偶联吞噬清除与炎症负反馈；AD脑内小胶质细胞高表达Axl与Mertk，其经Gas6/Protein S激活对斑块识别与吞噬至关重要，既往αAβ–Gas6融合蛋白也证实TAM信号可调控Aβ清除与神经炎症抑制，因此研究人员开展本研究，旨在设计抗炎性CAR小胶质细胞平台，在增强Aβ清除的同时抑制神经炎症激活。研究人员通过系统构建含TAM受体胞内信号域的Aβ特异性CAR，筛选得到AXL基CAR结构，在永生化髓系细胞系与人iPSC来源小胶质细胞样细胞中验证其Aβ摄取、溶酶体降解及抗炎能力，并在AD小鼠模型中评估体内移植后的Aβ清除效果与安全性，得出结论：基于TAM受体的AXL-CAR-iMGLs可整合抗原特异性Aβ清除与抗炎功能，在体外与体内均显著增强Aβ清除且不引发严重不良反应，为AD提供新型细胞治疗策略，该研究发表于《Frontiers in Immunology》，意义在于克服现有抗体疗法局限，将TAM信号与CAR工程结合，实现清除与抗炎双重功能，为神经退行性疾病细胞治疗提供新范式。
主要关键技术方法包括：使用人iPSC(源自研究团队既往工作表征株)、5xFAD小鼠(Jackson Laboratory)、FAD4T小鼠(Gempharmatech)、C57BL/6J小鼠(SLAC animal)作为实验材料；设计两版CAR构建体(V1含CD8铰链跨膜域、V2含TAM受体FNIII与跨膜段)并克隆至慢病毒载体；通过慢病毒转导构建稳定过表达人CSF1(hCSF1)的iPSC株，按已发表方案将CAR表达iPSC分化为小胶质细胞样细胞(iMGLs)；制备寡聚Aβ(oAβ)并偶联pHrodo荧光染料；通过PLX5622饮食耗竭小鼠内源性小胶质细胞，联合他克莫司免疫抑制后行海马区颅内注射移植iMGLs；采用共聚焦显微镜、流式细胞术、qPCR、Western blot、免疫荧光染色、三维重建及ImageJ量化分析Aβ负荷与细胞表型。
研究结果部分保留原文小标题并总结如下：
生成与筛选靶向Aβ的抗炎症CAR构建体。研究人员将Aβ特异性单链抗体(scFv)融合TAM受体胞内域设计并成功转导至Raw264.7与HMC3细胞，制备pHrodo偶联oAβ进行吞噬检测；共聚焦与流式结果显示所有TAM-CAR组oAβ吞噬效率显著高于截断CAR与野生型，其中AXL-CAR在Raw264.7与HMC3中均表现最强吞噬能力，证明TAM基CAR可显著增强小胶质细胞/巨噬细胞体外Aβ吞噬。
优化CAR设计：具有增强信号转导的第二版TAM-CAR。研究人员构建V2 CAR(保留TAM受体FNIII与跨膜段替代V1的CD8模块)，qPCR显示V2 AXL-CAR Raw264.7中SOCS1与SOCS3显著上调而V1无此效应；BV2细胞中V1与V2 AXL-CAR的oAβ吞噬水平相当；oAβ刺激60分钟后V2 AXL-CAR Raw264.7中STAT1磷酸化显著强于截断CAR与V1；AlphaFold2预测V2二聚体界面具多氢键而V1缺乏，表明V2界面稳定性增强是其下游信号与抗炎调节因子诱导更强的基础。
TAM基CAR-小胶质细胞抵抗炎症激活。研究人员在急性(LPS+oAβ)、 priming(LPS预激后oAβ)、慢性(oAβ长期)炎症范式下检测CAR Raw264.7与BV2的促炎因子mRNA；急性与priming模型中AXL-CAR显著抑制Il1a、Il1b、Tnf表达，抗炎表型最强；BV2中AXL-CAR在oAβ刺激16小时后Il1a、Il1b、Il6表达显著低于EGFP对照，证实TAM-CAR设计在上述条件下赋予细胞强抗炎响应，符合TAM信号免疫抑制已知作用。
人iPSC来源CAR-小胶质细胞样细胞在体外显示增加Aβ摄取与抗炎。研究人员将AXL-CAR与EGFP对照慢病毒转导人iPSC，经中胚层诱导、造血祖细胞特化、髓系分化生成iMGLs，表达IBA1与P2RY12小胶质细胞标志物；活细胞成像与流式显示AXL-CAR-iMGLs在2.5小时起oAβ吞噬显著增加，24小时摄取近两倍于对照，8小时流式证实增强吞噬；oAβ共培养24小时后AXL-CAR-iMGLs Il1a mRNA显著降低；5天共培养Western blot显示两组iMGLs均有效降解Aβ，免疫荧光示内吞oAβ与溶酶体标记LAMP1共定位，证明AXL-CAR-iMGLs体外可有效吞噬Aβ并经溶酶体降解且不增强炎症反应。
人CAR-iMGLs在体内显示改善的Aβ清除。研究人员为提升人iMGLs在鼠脑存活转导hCSF1，经PLX5622耗竭FAD4T与5xFAD小鼠内源性小胶质细胞并予他克莫司；6月龄5xFAD小鼠海马区注射PBS、EGFP-iMGLs或AXL-CAR-iMGLs，21天后免疫荧光显示AXL-CAR-iMGLs组海马Aβ斑块面积较PBS与EGFP组显著减少，斑块数量较PBS显著下降；流式显示移植iMGLs占局部小胶质细胞约10–15%；体重无显著损失；CA1区NeuN+神经元层厚度较PBS略有显著增加，CA1与齿状回(DG)突触素(SYP)密度无显著差异，表明AXL-CAR-iMGLs可在AD脑内成功植入、介导持续增强的体内Aβ清除且无明显神经毒性。
讨论部分总结：研究人员在讨论中指出本研究开发了新型抗炎Aβ靶向小胶质细胞细胞治疗策略，工程化AXL基CAR-iMGLs显著增强oAβ吞噬并降低炎性细胞因子，机制为CAR结合Aβ诱导STAT1磷酸化进而上调SOCS1/SOCS3抑制炎症基因；体内移植AXL-CAR-iMGLs在AD脑内植入并与淀粉样斑块相互作用驱动清除，实现清除与抗炎整合。转化角度看iPSC来源CAR-iMGLs可克服抗体疗法依赖Fc受体及ADCC风险，并提供规模化生产可能。局限性包括异种移植模型不能完全模拟人脑交互、植入细胞占比约15%、3周时间点移植细胞未完全恢复稳态、无法明确评估体内免疫调节与行为学影响；未来需用支持长期植入模型(如5xFAD-MITRG)、增设FcγR基CAR对照、探索静脉递送或纳米颗粒平台、拓展至Tau病理与组合疗法、多iPSC株验证及解决植入稳定性与扩增监管问题；近期其他研究亦报道TIM4基CAR、LNP-mRNA体内工程、分泌脑啡肽酶iMG、CAR星形胶质细胞等平行进展。结论部分翻译为：总之，本研究建立了一种新型“免疫工程”细胞治疗范式用于神经退行性疾病；通过以TAM基CAR工程化小胶质细胞，成功整合靶向Aβ清除与抗炎信号，在临床前AD模型中实现强效斑块清除；经进一步开发与优化，抗炎性CAR-iMGLs有望成为应对阿尔茨海默病及相关疾病中蛋白聚集与神经炎症双重挑战的有前景治疗策略。
