小鼠肝纤维化中肥大细胞的鉴定、纯化和表征：优化方法、表达特征及与严重程度的相关性

《Frontiers in Immunology》：Identification, purification and characterization of mast cells in murine liver fibrosis: optimized methods, expression signatures and correlation with severity

　　

引言：肥大细胞（MCs）是先天免疫系统的髓系细胞。作为第一道防线，它们发挥效应功能和免疫调节特性。激活后，MCs释放促炎介质，如细胞因子和蛋白酶。已有研究表明，MCs可能参与肝纤维化的发展。然而，由于小鼠肝脏中MC数量稀少，且缺乏依赖于MC蛋白及其修饰的合适检测技术，研究小鼠肝脏MC生物学颇具挑战。本研究评估了MC标志物的表达强度是否与小鼠肝纤维化程度相关，并旨在确定肝脏MCs的频率和定位。方法：研究人员在C57BL/6小鼠中同时应用了毒性（DEN/CCl4处理）和遗传性（Mdr2^-/-小鼠）肝纤维化模型，以评估MC标志物的表达强度是否与小鼠纤维化严重程度相关。通过荧光激活细胞分选（FACS）从纤维化小鼠肝脏中纯化肝脏MCs，并通过定量实时聚合酶链反应（qPCR）验证MC特异性基因表达。最后，研究人员旨在通过Molecular Cartography?在纤维化肝脏切片中确定肝脏MCs的频率和定位。结果：研究人员发现肝纤维化等级与多个已确立的MC标志物表达之间存在显著相关性。这一结果进一步得到来自纤维化和肝细胞癌（HCC）患者公开转录组数据集的分析支持。FACS分选的肝脏MCs主要不表达肥大细胞蛋白酶5（Mcpt5），且出现频率较低（约占白细胞总数的1-2%）。Molecular Cartography?揭示了小鼠肝脏MCs的空间定位、表达特征、丰度（约2个细胞/mm2）及细胞微环境。总结：研究人员证明了小鼠纤维化肝脏中存在MCs，并定义了与肝纤维化强度相关的MCs表达特征。这些发现将有助于未来更有效地研究小鼠肝脏疾病模型中MCs的生物学。

**论文解读：小鼠肝纤维化中肥大细胞的鉴定、纯化与表征——优化方法、表达特征及与疾病严重程度的相关性**

**研究背景与问题**

肥大细胞（Mast cells, MCs）是先天免疫系统的髓系细胞，传统上被认为是过敏反应的关键效应细胞。它们广泛分布于与环境接触的屏障组织（如皮肤、肺、胃肠道），但也存在于其他血管化器官（如肾脏和肝脏）。MCs通过抗原/过敏原交联免疫球蛋白E（IgE）负载的高亲和力IgE受体（FcεRI）被激活，激活后释放多种预先形成的炎症介质（如组胺、蛋白酶）以及新合成的介质（如花生四烯酸代谢物、细胞因子）。MCs的发育和存活依赖于干细胞因子（SCF）/KIT信号轴，KIT（受体酪氨酸激酶）在MCs上高表达，常与FcεRIα（由Fcer1a编码）共同作为MCs的谱系标志物。MCs可进一步分为黏膜型MCs（MMCs）和结缔组织型MCs（CTMCs），二者在解剖位置、细胞因子依赖性及颗粒蛋白酶表达方面存在差异。

近年来，人类研究提示MCs可能参与肝纤维化发生。例如，晚期原发性硬化性胆管炎（PSC）患者的肝活检组织显示出明显的MCs浸润，可通过甲苯胺蓝染色进行免疫组化检测。在代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）中，MCs密度也升高。在大鼠模型中，有证据表明表达糜酶的MCs可能参与非酒精性肝炎的发生和发展。然而，在小鼠肝纤维化模型中，MCs的存在及其确切作用仍不明确，主要原因在于：肝脏驻留MCs数量极低、小鼠特异性MC抗体的可用性有限，以及现有数据存在矛盾。本研究旨在确定小鼠纤维化肝组织中是否存在MCs，以及其表达特征是否与纤维化严重程度相关。为此，研究人员利用空间转录组学分析检测纤维化小鼠肝脏切片中的MCs，并在三种不同小鼠纤维化模型中进行MC标志物与纤维化进展的相关性分析，同时与患者数据进行比较。研究为未来利用小鼠模型研究肝脏疾病中MCs的生物学功能奠定了技术基础。

**主要关键技术方法**

本研究采用了以下主要关键技术方法（样本队列来源详见补充表1）：（1）在小鼠肝纤维化模型中，应用毒性诱导模型（DEN/CCl4处理，C57BL/6背景小鼠，n=29）和遗传性模型（Mdr2^-/-小鼠，C57BL/6背景，n=62），并利用公开数据集（GSE167216，CCl4处理小鼠，n=36）进行验证；（2）通过荧光激活细胞分选（FACS）从纤维化小鼠肝脏中纯化肝脏MCs，经CD45、CD11b、CD117（KIT）、FCER1A等抗体标记，结合流式细胞术分析及分选，并对分选细胞进行定量实时聚合酶链反应（qPCR）验证MC特异性基因表达；（3）采用Molecular Cartography?（空间转录组学技术，由Resolve BioSciences GmbH执行）对Mdr2^-/-小鼠（26周和52周龄）的甲醛固定石蜡包埋（FFPE）肝切片进行原位检测，通过多基因探针识别MCs；（4）进行生物信息学分析，利用TCGA-LIHC数据集（人类肝细胞癌患者，n=371肿瘤样本及50个匹配非肿瘤样本）验证小鼠发现与人类数据的一致性。

**研究结果**

**3.1 传统组化染色无法在小鼠肝脏中识别MCs**
研究人员尝试使用常规免疫组化染色方法（如阿尔新蓝、甲苯胺蓝）在纤维化小鼠肝脏中检测MCs，但在Mdr2^-/-小鼠肝实质中未能检测到MCs，而阳性对照（耳部皮肤）可成功染色。此外，KIT和FCER1A的免疫荧光共定位也未能在小鼠肝脏中观察到。

**3.2 MC特异性基因表达与三种独立小鼠模型中肝纤维化程度相关**
在DEN/CCl4处理小鼠模型中，qPCR结果显示MC标志物Kit、Fcer1a、Cpa3（羧肽酶A3）和Tpsb2（类胰蛋白酶β2）显著上调，而Mcpt5/Cma1（糜酶1）在纤维化肝脏中普遍下调。Pearson相关分析表明，Col1a1（胶原蛋白1α1，纤维化指标）的表达与Kit、Fcer1a、Cpa3、Tpsb2的表达显著正相关，而与Mcpt1、Mcpt2、Mcpt4、Mcpt5无显著相关。在Mdr2^-/-小鼠模型中，纤维化程度与Kit、Mcpt1、Mcpt2的表达显著正相关，但与Fcer1a、Cpa3、Tpsb2、Mcpt4、Mcpt5无显著相关。在公开数据集（GSE167216，CCl4处理小鼠）中，高表达MC标志物（Fcer1a、Cpa3、Tpsb2、Tpsab1、Cma1）的小鼠组表现出更严重的纤维化，且这些标志物与Col1a1表达显著相关，但Kit不相关。综合来看，不同模型间MC标志物与纤维化的相关性存在差异，表明MC特征依赖于损伤类型。

**3.3 小鼠与人类中MC标志物表达与肝纤维化进展的相关性存在相似性**
在TCGA-LIHC人类肝细胞癌（HCC）患者数据中，CPA3、TPSB2、TPSAB1的表达与COL1A1显著正相关，且KIT、FCER1A、CPA3、TPSB2、TPSAB1也与纤维化进展相关。值得注意的是，CMA1（人类Mcpt5同源基因）的表达与纤维化进展无显著相关，这与小鼠模型（DEN/CCl4及Mdr2^-/-）中观察到的结果一致。

**3.4 可通过FACS从小鼠肝脏中纯化MCs，且这些MCs通常不表达Mcpt5/Cma1**
研究人员利用Mcpt5-Cre转基因小鼠（与mT/mG报告基因小鼠及Mdr2^-/-小鼠杂交）建立FACS分选方案。通过流式细胞术，在CD45⁺白细胞中，KIT⁺FCER1A⁺的MCs约占1-2%。进一步分析显示，来自Mdr2^-/- mT/mG; Mcpt5-Cre小鼠肝脏的MCs中，仅约0.2%为EGFP阳性（即表达Mcpt5）。qPCR验证证实，分选的肝脏MCs几乎不表达Mcpt5，但表达Cpa3和Tpsb2，而Tpsab1仅在野生型（WT）肝脏MCs中检测到，在Mdr2^-/-肝脏MCs中未检测到。

**3.5 通过Molecular Cartography?原位鉴定小鼠肝脏MCs**
研究人员对Mdr2^-/-小鼠肝FFPE切片进行Molecular Cartography?分析。通过检测至少两种MC特异性基因（如Kit或Cpa3，联合Fcer1a、Cma1、Mcpt1等）的转录本，成功识别出MCs，平均密度约为2个细胞/mm2。这一方法首次在组织原位证实了小鼠纤维化肝脏中MCs的存在。

**讨论与结论**

本研究证实了小鼠纤维化肝脏中存在MCs，尽管其数量极低（约2个细胞/mm2），但通过FACS和空间转录组学可成功分离和鉴定。研究发现，MCs标志物表达与肝纤维化严重程度呈显著相关性，且这种相关性在不同损伤模型（毒性模型与胆汁淤积模型）中存在差异，提示MCs的表型特征依赖于损伤微环境。在Mdr2^-/-小鼠中，MCs表现出黏膜型MCs（MMCs）的特征（表达Mcpt1、Mcpt2，不表达Mcpt5），而在CCl4相关模型中，MCs更类似于结缔组织型MCs（CTMCs，表达Cpa3、Tpsb2、Mcpt5）。这些发现与人类HCC患者数据一致，表明小鼠肝脏MCs与人类肝脏MCs在基因表达特征上具有相似性。研究还建立了从肝脏中分离纯化足够数量MCs的方法，为未来开展单细胞RNA测序及功能研究奠定了基础。研究结论部分（翻译）：研究人员证明了小鼠纤维化肝脏中存在MCs，并定义了与肝纤维化强度相关的MCs表达特征。这些发现将有助于未来更有效地研究小鼠肝脏疾病模型中MCs的生物学。尽管研究存在局限性（如基于相关性、未评估MC功能、MC标志物可能在其他细胞中表达、MC丰度极低），但本研究为后续在小鼠肝纤维化模型中探索MCs的潜在因果作用提供了坚实的技术和科学基础。