综述：回顾化学诱导的啮齿动物肝硬化相关肝癌发生的两阶段模型：方法与组织病理学方法

《Journal of Molecular Histology》：Revisiting two-stage models of chemically-induced cirrhosis-associated hepatocarcinogenesis in rodents: methodological and histopathological approaches

　　

反复暴露于肝毒素如四氯化碳（CCl₄）、硫代乙酰胺（TAA）或二乙基亚硝胺（DEN）已被频繁用于诱导啮齿动物纤维化/肝硬化。在本叙述性综述中，研究人员比较了在DEN启动的大鼠和小鼠中使用不同CCl₄或TAA方案的两阶段中期方案。此外，研究人员回顾了之前的两阶段DEN/CCl₄或DEN/TAA大鼠模型，以比较纤维化等级、胎盘型谷胱甘肽S-转移酶（GST-P）阳性肝细胞病变占据肝脏面积的均数和百分比。因此，研究人员评估了两组雄性Wistar大鼠，它们接受DEN（单次剂量）作为肝癌发生的启动剂，随后接受CCl₄或TAA方案（多次剂量）直至第25周。两组雄性Wistar大鼠均表现出较低的体重增加和较高的肝重、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平、肝细胞增殖，以及明显的纤维化/肝硬化、GST-P阳性癌前病变和肝肿瘤的发展。然而，雄性Wistar大鼠的DEN/TAA方案作为纤维化/肝硬化相关肝癌发生模型更为有效，因为TAA能有效加速肝脏疾病进展和癌变。此外，这些化学方案已被前瞻性研究为适合且有效的方案，在多种分子和形态学结果上类似于相应的人类疾病。总之，两阶段DEN/CCl₄或DEN/TAA啮齿动物模型能有效模拟纤维化相关肝癌发生的进展，适用于预防或治疗研究。

**Introduction**
全球流行病学数据显示，慢性肝病中晚期肝纤维化和肝硬化患病率持续上升，分别影响约3.3%和1.3%的人群，且在非洲、欧洲和北美大陆尤为突出。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是恶性程度最高的肝癌之一，其致死率居癌症相关死亡率前列，而肝硬化是80-90% HCC病例的主要危险因素。肝硬化的进展涉及进行性纤维生成、肝细胞坏死/再生循环，以及结节形成、门静脉高压和肝功能衰竭。化学诱导的啮齿动物模型，如使用四氯化碳（CCl₄）、硫代乙酰胺（TAA）或二乙基亚硝胺（DEN）单独或联合给药，已被广泛用于模拟纤维化/肝硬化相关肝癌发生。为明确这些模型的转化价值，特别是两阶段（DEN启动后给予CCl₄或TAA促进）方案，本文综述了相关方法学和形态学结果。

**Rodent models of fibrosis-associated hepatocarcinogenesis using a single agent**
DEN是一种经典肝癌原，经细胞色素P450 2E1（CYP2E1）代谢生成活性氧（reactive oxygen species, ROS）和乙基重氮离子，诱导DNA损伤和基因组不稳定性。在啮齿动物中，单次或多次DEN注射在不同剂量和年龄下诱发HCC的效率和有效性各异，幼龄动物因肝细胞增殖率高而更易启动肝癌发生。CCl₄同样经CYP2E1代谢产生三氯甲基自由基（•CCl₃）和三氯甲基过氧自由基（•OOCCl₃），导致氧化应激和肝损伤。长期使用CCl₄（灌胃或腹腔注射）可引起肝细胞死亡、炎症、纤维化/肝硬化，伴随肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）激活和胶原合成增加。然而，CCl₄单独使用时仅在极长暴露时间（2年）和高毒性剂量下才产生较高HCC负荷。TAA通过CYP2E1和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖性单加氧酶氧化活化，生成S-氧化物（TAASO）和S,S-二氧化物（TAASO₂），消耗抗氧化酶并损伤肝细胞和胆管细胞。慢性TAA给药（腹腔注射或饮水）可促进氧化应激、细胞死亡、炎症反应，最终导致肝纤维化和肝硬化。虽然TAA单独使用在长期（34周）可诱导HCC和胆管癌，但中期暴露（8-30周）并不能有效建立纤维化相关肝癌发生模型。因此，采用DEN启动后慢性CCl₄或TAA给药的两阶段模型更为适宜。

**Comparison of previous two-stage rat models using DEN/CCl₄ or DEN/TAA regimens**
研究人员重新评估了既往两项25周的两阶段大鼠模型，其中成年雄性Wistar大鼠先接受单次DEN（200 mg/kg）腹腔注射，两周后分别开始CCl₄（灌胃，每周一次，剂量从0.5 ml/kg递增至1.0 ml/kg）或TAA（腹腔注射，每周两次，连续三周后停一周，共重复至25周）方案。与对照组相比，两个模型均显著降低体重增加、增加肝脏绝对和相对重量、升高血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）水平，并促进肝细胞增殖。通过天狼猩红染色评估胶原沉积和纤维化评分（0-4级），两个模型均出现明显肝硬化（80-100%，评分3-4），且无死亡和显著腹水。胎盘型谷胱甘肽S-转移酶（placental glutathione S-transferase, GST-P）免疫组化分析显示，两模型均产生GST-P阳性的癌前病灶（改变肝细胞灶和增生结节）以及HCC等肿瘤。然而，DEN/TAA方案在血清ALT水平（p=0.0278）、肝胶原含量（p=0.0101）、GST-P阳性病灶数量和面积（p<0.0001）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）阳性肝细胞数（p=0.0054）以及每只大鼠的肝肿瘤数量（6.80±3.65 vs 3.80±2.49，p=0.045）方面均显著高于DEN/CCl₄组。这表明TAA方案能更有效地加速肝病进展和癌变，其机制与TAA经CYP2E1氧化活化形成的硫基代谢物（TAASO和TAASO₂）导致蛋白质羰基化、DNA损伤、ROS生成及线粒体损伤，进而激活HSC并促进纤维化相关肝癌发生有关。而CCl₄作为主要肿瘤促进剂，氧化应激机制更强，但其致癌性相对较弱。两模型在多数参数上显示出高度相似性，但TAA方案在诱导癌前病变和肿瘤方面优势明显，更适用于模拟人类肝硬化背景下的晚期肝癌发生。

**Conclusions and future perspectives**
两阶段DEN/CCl₄或DEN/TAA啮齿动物模型具有显著的转化价值，能有效模拟人类肝硬化相关肝癌发生的进展过程。鉴于HCC治疗手段（如肝切除、移植、射频消融）在疾病晚期效果有限，预防性干预研究至关重要。多种天然生物活性化合物（如α-硫辛酸、维生素D3、咖啡生物活性化合物、辛伐他汀等）已在不同DEN + CCl₄和DEN + TAA方案中作为预防或治疗策略被测试。未来需利用多组学整合分析（单细胞转录组学、空间转录组学、蛋白质组学、代谢组学）深入阐明模型机制，例如单细胞转录组（scRNA-seq）在TAA或CCl₄诱导的纤维化模型中揭示了HSC、Kupffer细胞和T细胞亚群的差异性调控模式。然而，本研究存在明显局限：仅采用单一CCl₄和TAA给药方案，未设置单一化学物对照组以区分各自贡献；高系统毒性和动物死亡率限制了长期干预；且模型不能完全再现人类代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）或胰岛素抵抗特征。尽管如此，这些经典的两阶段模型仍是研究肝硬化相关肝癌发生机制及评估预防/治疗策略的实用工具。