《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》：Selenite modulates phenotype-dependent epithelial–mesenchymal plasticity in pancreatic ductal adenocarcinoma: integrated in vitro analyses and patient-derived ex vivo tissue-slice cultures
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背景：胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)具有显著的治疗抵抗、促结缔组织增生及表型可塑性特征。亚硒酸钠(Sodium selenite)是一种氧化还原活性化合物，据报道具有肿瘤选择性细胞毒性，但其对PDA
背景：胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)具有显著的治疗抵抗、促结缔组织增生及表型可塑性特征。亚硒酸钠(Sodium selenite)是一种氧化还原活性化合物，据报道具有肿瘤选择性细胞毒性，但其对PDAC中上皮–间质转化(Epithelial–mesenchymal transition, EMT)状态的影响尚未明确界定。研究人员探讨了亚硒酸钠是否在剂量和情境依赖的方式下调控EMT相关表型，使用互补的体外和患者来源的离体模型，并将标志物变化与PDAC组织切片中的组织学肿瘤消退相关联。方法：使用定量免疫荧光对三种具有不同基线EMT状态的PDAC细胞系（PANC?1、HPAF?II、Capan?2）进行预定义上皮（EpCAM、细胞角蛋白cytokeratin、E?cadherin）和间质相关（AHNAK2、ITGAV、波形蛋白vimentin）蛋白面板分析，含或不含TGF?β预处理。来自治疗初治、非转移性PDAC切除术的离体组织切片（n = 10）在患者内配对设计中培养（0 h、24 h、48 h对照；第二个24 h给予5或15 μM亚硒酸钠）。由盲法胰腺病理学家（Evans；CAP）评分组织学肿瘤消退，区室分辨的标志物表达通过多重免疫荧光量化，并在部分供体中（n = 4）进行配对RNA测序。结果：体外实验中，反应具有表型依赖性：上皮偏向的HPAF?II和Capan?2系显示部分上皮强化和间质标志物（特别是ITGAV、vimentin）的持续减少，而间质偏向的PANC?1显示有限调控。TGF?β预处理减弱了促进上皮的效应，而在细胞系依赖的方式下保留了间质标志物的抑制。在离体切片中，亚硒酸钠诱导了剂量依赖的组织学肿瘤消退改善，并在15 μM时增加了肿瘤区室的上皮–间质比值，主要由上皮标志物上调驱动，而间质标志物未显示一致抑制。在15 μM时，转录组学揭示了一个紧凑的治疗反应，其特征是基底膜/细胞外基质(ECM)模块下调，而未在EMT基因集间广泛逆转；EMT评分显示在5 μM时存在异质性偏移，在大多数供体中15 μM时更一致地偏向上皮偏移。结论：亚硒酸钠主要与恶性PDAC区室中上皮特征的强化相关，这种方式依赖于基线状态、剂量和情境，较高剂量的表型偏移伴随着临床相近模型中更强的组织学肿瘤反应。
研究背景方面，胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)是全球致命性最高的恶性肿瘤之一，具有快速局部进展、早期播散及全身治疗持久缓解率低的特点，总体五年生存率仅约10%。手术切除是唯一潜在治愈手段，但仅不到20%患者确诊时可切除。现有联合化疗方案获益有限且受累积毒性和耐药限制。PDAC的高治疗抵抗、致密促结缔组织增生(desmoplasia)及显著瘤内异质性与表型可塑性进一步损害预后。肿瘤氧化还原失衡造成慢性氧化应激，使其对额外氧化还原破坏敏感。亚硒酸钠(Sodium selenite)作为无机氧化还原活性化合物，可通过活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)生成及下游凋亡、铁死亡等细胞死亡通路发挥报道的肿瘤选择性细胞毒性，并在多种实体瘤及人PDAC离体组织中显示抗肿瘤活性，早期临床试验也支持其高剂量给药可行性。氧化还原信号与核心上皮–间质转化(Epithelial–mesenchymal transition, EMT)通路相交联，可能影响EMT动力学，但亚硒酸钠对PDAC肿瘤可塑性的影响尚不清楚。EMT并非二元开关而是连续谱，间质–上皮转化(Mesenchymal–epithelial transition, MET)被认为可能降低侵袭并改善治疗响应，但需明确氧化还原活性剂能否调控PDAC中EMT相关表型及其对基线状态和微环境背景的依赖性。为此，研究人员整合具不同基线EMT状态的PDAC细胞系及患者来源离体PDAC组织切片培养，在剂量和情境依赖方式下评估亚硒酸钠对EMT相关表型的调控，并关联组织学肿瘤消退与转录组响应。
研究人员开展的研究及结论与意义方面，研究人员通过互补的体外与离体模型探讨亚硒酸钠是否以剂量和情境依赖方式调控PDAC中EMT相关表型（包括在EMT诱导条件下），并将标志物偏移与离体组织切片中组织学肿瘤消退相关联。得出结论为亚硒酸钠主要与恶性PDAC区室中上皮特征强化相关，这种方式依赖于基线状态、剂量和情境，较高剂量表型偏移伴随临床相近模型中更强组织学肿瘤反应。该研究的整合框架有助于桥接临床前氧化还原生物学与临床观察到的亚硒酸钠反应变异性，支持在保留肿瘤结构与间质背景的模型中继续转化评估亚硒酸钠在PDAC中的应用。论文发表在《Journal of Experimental 》 。
主要关键技术方法方面，研究采用三种具不同基线EMT状态的PDAC细胞系（PANC?1、HPAF?II、Capan?2）进行定量免疫荧光分析预定义上皮与间质相关蛋白面板，并设TGF?β预处理组；使用来自瑞典卡罗林斯卡大学医院治疗的初治非转移性PDAC切除标本（n = 10，2022年5月至2024年3月）建立离体组织切片培养并在患者内配对设计中予5或15 μM亚硒酸钠处理；由盲法胰腺病理学家依据Evans分级与CAP标准评分组织学肿瘤消退；通过多重免疫荧光定量区室分辨标志物表达并计算上皮–间质比值；在部分供体（n = 4）中对0 h、48 h对照及5/15 μM处理条件进行配对RNA测序，经质量质控、比对、定量及edgeR配对设计差异表达分析，并基于策选EMT参考基因集进行多种EMT评分与功能富集分析。
研究结果方面
In vitro EMT phenotypes and selenite responses in PDAC：研究人员通过基线免疫荧光发现PANC?1呈间质偏向模式（高Vimentin、AHNAK2，低上皮标志物），HPAF?II与Capan?2以上皮标志物为主（高EpCAM/E?cad，低Vimentin、ITGAV），上皮–间质比值在HPAF?II与Capan?2高而PANC?1显著降低。剂量–反应曲线显示HPAF?II最敏感、Capan?2中等、PANC?1最低，TGF?β预处理不改变亚硒酸钠敏感性。亚硒酸钠处理后，PANC?1仅浓度依赖性降低EpCAM，上皮与多数间质标志物基本稳定；HPAF?II上皮标志物升高、Vimentin与ITGAV降低；Capan?2细胞角蛋白增加、ITGAV剂量依赖性下降、Vimentin在24 μM降低，上皮–间质比值在HPAF?II与Capan?2中度增加而PANC?1维持低值，表明上皮偏向细胞系出现部分上皮偏移。TGF?β预处理减弱上皮促进效应但保留间质标志物抑制的细胞系依赖性特征，上皮–间质比值变化与之对应，PANC?1无改变，HPAF?II仍增加，Capan?2仅在24 μM显著增加。
Ex vivo selenite responses in patient-derived PDAC tissue slices：队列含10例切除PDAC患者（中位年龄73.5岁，pT2–pT3，9/10淋巴结阳性，均为M0；所有肿瘤具致病性KRAS突变）。盲法病理学家评估显示亚硒酸钠处理引起剂量依赖组织学肿瘤消退改善：5 μM时Evans分级多为1–2a，CAP评分多3；15 μM时Evans分级转向2a–3（7/10高反应），CAP评分1–2者8/10，配对比较两剂量差异显著。探索性相关分析显示5 μM时Evans分级与TNM分期相关，15 μM时回归与年龄、肿瘤大小相关，但未显示与KRAS变异类型、p53免疫组化模式或分化等级的清晰关系。
基线区室标志物和培养时间效应分析显示0 h切片中EpCAM在腺泡组织高于肿瘤与导管区，细胞角蛋白在肿瘤与导管高于腺泡，AHNAK2在肿瘤最高；上皮–间质比值肿瘤高于腺泡。培养时间效应中腺泡组织各标志物稳定；肿瘤区EpCAM在24 h较基线升高、48 h回基线，细胞角蛋白48 h高于0 h，E?cad基本不变，间质标志物各时间点稳定，上皮–间质比值0–24 h升高后无进一步变化，支持以48 h未处理为治疗比较参照。
区室特异性EMT标志物变化显示腺泡组织中仅EpCAM在15 μM升高，其余无显著变化，上皮–间质比值稳定。肿瘤区亚硒酸钠主要上调皮标志物：EpCAM剂量依赖性增加，E?cad在5与15 μM均增加，AHNAK2在5 μM升高、15 μM回基线，Vimentin与ITGAV无一致变化；肿瘤上皮–间质比值在15 μM显著增加。个体水平组织学反应评分与治疗诱导肿瘤上皮–间质比值变化无强关联。探索性分析显示部分剂量与标志物特定关联（如5 μM时ΔVimentin与年龄正相关、Δ细胞角蛋白与肿瘤大小负相关；15 μM时TNM分期与ΔVimentin及ΔΔ Vimentin正相关），但属假设生成性质。
RNA?seq方面显示0 h与48 h对照间差异表达反映培养时间适应，上调富集细胞外基质(ECM)重塑与黏附相关过程，下调富集结构性ECM与弹性纤维模块。Transcriptional changes associated with ex vivo culture duration 支持48 h未处理为参照。Dose?dependent selenite effects on EMT?related transcription 显示5 μM在策选EMT相关子集无显著差异表达；15 μM诱发紧凑反应：少量上调即刻早期/应激应答基因（GADD45B、JUN、MSX1、RHOB、CCN1、CNNM4）与较多下调基底膜/ECM相关基因（COL4A1、COL4A2、FBN1、LAMA2、LAMC1、LOXL2、MXRA5、NID2、SPOCK1、TGFBI、VCAN、WIPF1、TCF4），富集分析下调项含基底膜、ECM组织、层粘连蛋白相互作用、ECM–受体相互作用、局灶黏附及PI3K?Akt信号通路；对应蛋白面板转录本在同一阈值下未达显著差异。EMT评分显示5 μM时异质性偏移（MLR式指标2/4上皮、2/4间质；面板指标3/4上皮），15 μM时三家指标均显示3/4供体上皮偏向偏移、1/4间质偏向，跨指标一致性在15 μM更高。
讨论部分总结方面，研究人员指出亚硒酸钠氧化还原破坏与细胞毒性虽已有表征，但其调控胰腺癌上皮–间质特征潜力探索较少；本研究首次整合体外–离体PDAC分析亚硒酸钠相关EMT调控，涵盖EMT谱细胞系（±TGF?β）与患者来源切片，并将多重免疫荧光与肿瘤消退分级及配对RNA?seq三角互证。体外显示间质偏向PANC?1仅有限调控、上皮偏向HPAF?II与Capan?2更清晰沿EMT轴偏移（抑制间质标志物ITGAV、Vimentin并增加上皮–间质比值），与EMT可逆性状态依赖及他瘤种报道方向一致但本研究明确基线状态依赖。TGF?β预处理在不同细胞系产生不同响应：PANC?1进一步限制上皮标志物反应，HPAF?II与Capan?2保留上皮促进反应但幅度不同，提示EM平衡偏移多见于间质承诺部分且潜在可逆背景。离体切片中基线EMT标志物反映原肿瘤组织，培养早期肿瘤区上皮标志物短暂增加、腺泡稳定；0 h与48 h对照转录特征主要为培养适应（ECM/黏附重塑与结构性ECM/弹性纤维下调），而非EMT重编程。亚硒酸钠在离体PDAC切片中主要上调肿瘤上皮标志物（EpCAM、E?cad）而无一致间质抑制，EMT调控主要通过上皮特征强化而非广泛间质程序抑制，具区室特异性并与肿瘤氧化还原脆弱性一致；反应呈剂量依赖：15 μM较5 μM组织学肿瘤消退显著增强、肿瘤上皮–间质比值显著增加，转录上15 μM以基底膜/ECM与黏附模块下调为特征（含TGF?β可诱导TGFBI），而非典型MET转录切换；三家EMT指标均支持剂量依赖上皮强化与供体变异性，5 μM异质、15 μM更一致上皮偏移。供体差异可能受组织成分影响（PDAC高促结缔组织增生，选择性恶性上皮损伤使低肿瘤分数标本上皮信号降低、批量评分受间质主导呈表象间质偏移）；本研究 outlier 供体具可比消退但肿瘤ROI内多重IF仍示15 μM上皮偏移，突显肿瘤cellular含量/间质成分潜在混淆。探索性关联未显示肿瘤区上皮–间质比值变化与性别、分化、血管侵犯、KRAS变异或p53模式一致关联；个别剂量与标志物特定关联（如5 μM年龄与ΔVimentin、肿瘤大小与Δ细胞角蛋白；15 μM TNM分期与ΔVimentin及ΔΔ Vimentin）属假设生成。局限包括连续切片致PanIN与导管区代表不足、队列限可切除PDAC、批量RNA?seq仅4例供体且受肿瘤–间质比影响（部分由配对设计与肿瘤ROI限制IF缓解）；未将效应归因于特定调节性细胞死亡通路或区分存活肿瘤细胞表型调控与特定肿瘤细胞状态选择性丢失，需后续机制研究。总体而言，该研究在PDAC模型中提供临床相近、区室分辨视角，显示氧化还原破坏可伴EMT相关表型偏移，亚硒酸钠主要作用于恶性区室并关联上皮特征强化与较高剂量下ECM/黏附程序阻尼，支持在保留结构与间质背景的模型中继续转化评估PDAC中亚硒酸钠及识别剂量依赖EMT相关反应修饰因子。
研究结论部分翻译：总之，亚硒酸钠在PDAC模型中诱导了剂量和情境依赖的EMT相关特征偏移。体外实验中，上皮偏向细胞系显示最清晰的上皮强化与选择性间质标志物抑制，而间质偏向细胞系响应较低。在患者来源PDAC组织切片中，亚硒酸钠相关EMT标志物变化在恶性区室最明显，其中较高剂量亚硒酸钠伴随更强组织学肿瘤消退与肿瘤上皮–间质比值增加。配对转录组学表明，除培养时间适应外，较高剂量亚硒酸钠伴随基底膜/细胞外基质(ECM)与黏附相关程序的聚焦下调，而非典型MET转录转换。总之，这些数据支持在PDAC中使用成分感知、区室分辨模型继续转化评估亚硒酸钠，并推动识别分子与组织病理学反应修饰因子以理解剂量依赖EMT相关反应。
