新型eDNA检测方法（基于单物种与并行高通量实时荧光定量PCR（High-Throughput real time PCR, HT-qPCR））的开发用于两种欧洲铃蟾属（Bombina）物种的检测

《Conservation Genetics Resources》：Development of new eDNA assays for the detection of two European fire-bellied toads (Bombina) via single-species and parallel High-Throughput real time PCR

　　

研究人员开发并验证了两种针对当地濒危的黄腹铃蟾（Bombina variegata）与红腹铃蟾（B. bombina）的物种特异性环境DNA（environmental DNA, eDNA）检测方法，并进行了全面的计算机模拟（in silico）、体外（in vitro）与体内（in vivo）测试。研究人员利用单物种实时荧光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）以及在Biomark HD系统上使用不同预混液（master mix）化学性质的高通量实时荧光定量PCR（High-Throughput qPCR, HT-qPCR）对野外样本评估了检测性能。分析流程显著影响了循环阈值（Cycle threshold, Ct）值，由于前期的预扩增（pre-amplification）步骤，HT-qPCR产生的Ct值始终低于qPCR。两种HT-qPCR预混液在野外样本中均表现出可比的检测性能，结果一致且具有重现性。对于黄腹铃蟾（B. variegata）样本，HT-qPCR流程显著提高了检出率。新型检测方法适用于应用型的eDNA监测，并可作为传统两栖动物监测计划的稳健补充。研究人员开发并验证了两种针对当地濒危的黄腹铃蟾（Bombina variegata）与红腹铃蟾（B. bombina）的物种特异性环境DNA（eDNA）检测方法，并进行了全面的计算机模拟、体外与体内测试。研究人员利用单物种实时荧光定量PCR（qPCR）以及在Biomark HD系统上使用不同预混液化学性质的高通量实时荧光定量PCR（HT-qPCR）对野外样本评估了检测性能。分析流程显著影响了Ct值，由于前期的预扩增，HT-qPCR产生的Ct值始终低于qPCR。两种HT-qPCR预混液在野外样本中均表现出可比的检测性能，结果一致且具有重现性。对于黄腹铃蟾样本，HT-qPCR流程显著提高了检出率。新型检测方法适用于应用型的eDNA监测，并可作为传统两栖动物监测计划的稳健补充。

论文《Development of new eDNA assays for the detection of two European fire-bellied toads (Bombina) via single-species and parallel High-Throughput real time PCR》发表在《Conservation Genetics Resources》。该研究针对欧洲黄腹铃蟾（Bombina variegata，以下简称BV）与红腹铃蟾（B. bombina，以下简称BB）种群数量持续下降及栖息地丧失的现状，指出在种群密度极低且分布斑块化的区域，传统的铃蟾属（Bombina）物种监测存在困难。因此，研究人员开展此项研究，旨在开发并验证高灵敏度的环境DNA（environmental DNA, eDNA）检测方法，以便于在水样中快速高效监测这两种物种，该方法兼具单物种实时荧光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）分析与使用Biomark HD微流体平台的高通量实时荧光定量PCR（High-Throughput qPCR, HT-qPCR）双重用途。研究通过全面的计算机模拟（in silico）、体外（in vitro）与体内（in vivo）测试验证了方法的可靠性，得出HT-qPCR流程尤其在BV样本上显著提升检出率的结论，证实新方法可作为传统两栖动物监测计划的稳健补充。

为开展研究，研究人员主要采用的关键技术方法包括：基于西欧和中欧常见两栖动物完整线粒体DNA及细胞色素c氧化酶亚基I（Cytochrome c oxidase subunit I, COI）序列设计物种特异性引物与TaqMan MGB探针并进行计算机模拟验证；利用包含目标物种、17种欧洲非目标两栖动物及人类DNA进行交叉扩增测试；在Quantstudio3系统上进行单物种qPCR分析，在Biomark HD系统上使用96.96动态阵列集成流体电路（Integrated Fluid Circuit, IFC）进行包含预扩增（pre-amplification）步骤的HT-qPCR分析，比较TaqMan Fast Advanced Master Mix（AMM）与TaqMan Environmental Master Mix 2.0（EMM2.0）两种预混液化学性质；使用gBlock标准品构建标准曲线及外源内部阳性对照（Exogenous Internal Positive Control, IPC）检测PCR抑制；样本队列来源于2021年5月至6月采自德国黑森州6个站点及萨克森州3个已知物种分布的站点，以及1个已知无目标物种的负对照站点Kinzigaue1的自然与先锋栖息地（挖掘坑洞）水样，并依据规范流程进行eDNA过滤提取与Sanger测序验证。

研究结果部分保留原文逻辑阐述如下：

首先涉及物种特异性引物与探针设计及验证。研究人员针对BV的COI基因101 bp片段与BB的94 bp片段设计了特异性引物与探针。计算机模拟与体外交叉扩增测试显示，两种检测方法与目标序列100%同源，且对17种非目标欧洲两栖动物及人类DNA无交叉扩增，验证了高度的特异性。

其次涉及分析流程对Ct值及检测性能的影响。现场验证表明，分析流程显著影响循环阈值（Cycle threshold, Ct）值（F_2,28= 789.6, p < 0.001）。由于HT-qPCR前期的预扩增步骤，其Ct值始终低于单物种qPCR，其中HT-qPCR EMM2.0产生最低Ct值，依次为HT-qPCR AMM与qPCR（Tukey校正p < 0.001）。两种HT-qPCR预混液化学性质表现出近乎一致的性能与强一致性，尽管测量的Ct值存在系统性偏移。在检测率方面，BV检测中HT-qPCR达90–100%而qPCR仅为40%，HT-qPCR流程大幅提升了BV的检出率；BB检测则在所有流程中均能一致检出目标物种。所有流程的平均分析内变异（intra-assay variation）低于15%，表明技术重现性可接受。负对照站点Kinzigaue1未检测到污染。

最后涉及eDNA标记验证尺度评估。依据eDNA标记验证尺度（Thalinger et al. 2021），新型铃蟾属检测方法满足直至第3级的所有最低标准，包括检测限（Limit of Detection, LOD）/定量限（Limit of Quantitation, LOQ）估算，证明其具备稳健的即用型方法论特征。

总结讨论部分，研究人员经全文论证得出结论：所开发的两种新型eDNA检测方法通过全面的计算机模拟、体外与体内测试验证，成功应用于德国黑森州与萨克森州野外水样检测。分析工作流程对Ct值影响显著，HT-qPCR因预扩增步骤产生更低Ct值，且两种HT-qPCR预混液化学性质表现可比。特别是对于黄腹铃蟾样本，HT-qPCR工作流程大幅改善了检测率。该方法符合eDNA assay验证尺度至第3级要求，适用于应用型eDNA监测，能有效互补传统两栖动物监测项目。翻译其结论为：新型检测方法是适用于应用型eDNA监测的稳健即用型方法论，可作为传统两栖动物监测计划的强力补充。

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