PLX3397重塑肝脏脂质代谢独立于小胶质细胞耗竭

《Neuroscience Bulletin》：PLX3397 Reshapes Hepatic Lipid Metabolism Independent of Microglial Depletion

　　

集落刺激因子1受体（CSF1R）抑制剂，如PLX5622和PLX3397（pexidartinib），被广泛用于体内小胶质细胞耗竭以及研究小胶质细胞功能和治疗潜力。尽管基于CSF1R抑制剂的研究揭示了小胶质细胞在麻醉、成瘾和肥胖等过程中的重要作用，但所得表型是否仅反映小胶质细胞耗竭这一观点日益受到争议。研究人员先前的研究表明，PLX5622激活肝脏组成性雄烷受体（CAR）依赖性异源物代谢，改变麻醉剂和成瘾药物的代谢，并放大表观小胶质细胞表型。其他CSF1R抑制剂，尤其是FDA批准的PLX3397，是否会产生可能影响脑表型解释的系统性代谢效应仍未知。在此，研究人员证明PLX3397发挥的肝脏代谢效应在机制上不同于PLX5622诱导的效应。尽管PLX3397仅微弱影响异源物代谢，但它显著增强内源性肝脏脂质代谢，诱导出一种类似禁食的状态，其特征是在没有营养剥夺的情况下脂质利用增加和酮体生成增多。通过揭示PLX3397先前未被认识的外周效应，研究人员的发现将脑-外周相互作用确定为小胶质细胞功能研究中潜在的混淆来源。这些结果表明，在药物性小胶质细胞耗竭范式下解释神经或行为表型时，应仔细考虑系统性代谢效应。

**论文解读：PLX3397独立于小胶质细胞耗竭重塑肝脏脂质代谢**

**研究背景与问题**
小胶质细胞是大脑主要的固有免疫细胞，通过免疫和非免疫机制维持稳态并调节神经元活动。传统小胶质细胞操作依赖转基因小鼠模型，耗时且成本高，因此药理学小胶质细胞耗竭成为高效实用的研究方法。其中最广泛使用的策略是抑制集落刺激因子1受体（CSF1R），该受体对小胶质细胞存活至关重要。小分子CSF1R抑制剂如PLX5622和PLX3397（pexidartinib）能快速、可逆地耗竭小胶质细胞，且具有良好血脑屏障通透性和口服生物利用度。PLX3397已获美国FDA批准用于治疗腱鞘巨细胞瘤，PLX5622则在临床评估中。使用这些抑制剂的研究揭示小胶质细胞耗竭在睡眠调节、麻醉、成瘾和肥胖等过程中的意外效应，这些效应通常归因于小胶质细胞丢失。然而，研究人员前期工作发现PLX5622激活肝脏组成性雄烷受体（CAR）并加速异源物代谢，增强麻醉剂和成瘾药物的清除，可能混淆小胶质细胞功能的解读。因此，广泛使用的CSF1R抑制剂PLX3397是否产生类似或不同的外周脱靶效应仍不清楚。开展本研究旨在系统比较PLX3397和PLX5622在脑和肝脏中的效应，以揭示PLX3397潜在的外周代谢影响及其对小胶质细胞研究的意义。

**研究内容与结论**
研究人员通过喂食含PLX3397或PLX5622的饲料对小鼠进行为期两周的处理，比较两种抑制剂在脑和肝脏中的效应。结果发现，两种抑制剂均高效耗竭脑内小胶质细胞（约99%），产生广泛相似的转录组谱，仅在残余小胶质细胞形态上存在差异。然而，肝脏转录组分析显示两种化合物诱导截然不同的效应：与PLX5622不同，PLX3397不激活肝脏异源物代谢，而是诱导以脂肪酸代谢增强、胆固醇和甘油三酯生物合成减少为特征的代谢重塑。这种代谢转变类似禁食样代谢状态，表现为酮体代谢增强，在正常生理和高胆固醇血症模型下均显著降低胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸水平。通过揭示PLX3397独特的肝脏脂质代谢重塑程序，研究人员的发现为使用PLX3397研究小胶质细胞功能提供了框架，并可能对其临床应用有启示意义。该论文发表在《Neuroscience Bulletin》。

**主要关键技术方法**
1. **动物模型与样本来源**：8周龄C57BL/6J小鼠购自查尔斯河（北京）；Cx3cr1^CreERT2小鼠购自Jackson Laboratory（Jax #021160）；R26^iDTR/iDTR小鼠由浙江大学胡海岚博士提供。所有动物饲养于上海交通大学动物核心设施。
2. **免疫荧光与形态学分析**：使用Iba1抗体染色脑和肝脏切片，通过FV-3000共聚焦显微镜采集图像；使用IMARIS软件进行三维重建，ImageJ进行骨架化分析，定量胞体面积、分支总长度和末端端点数。
3. **RNA测序与生物信息学分析**：提取脑和肝脏总RNA，由诺禾致源构建cDNA文库并在Novaseq6000上测序；使用DESeq2鉴定差异表达基因（|fold change|>2，校正P<0.05），clusterProfiler进行基因本体（GO）富集分析。
4. **质谱分析**：使用高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）定量血浆和肝脏中的戊巴比妥浓度，色谱分离在Waters Acquity UPLC BEH C18柱上进行，负电喷雾电离（ESI-）模式多反应监测（MRM）检测。
5. **生化指标测定**：使用商业试剂盒测定血浆和肝脏中甘油三酯（TAG）、总胆固醇（T-CHO）、游离脂肪酸（FFA）和β-羟基丁酸（BHB）水平。
6. **代谢笼分析**：使用综合实验室动物监测系统（CLAMS）通过间接测热法评估能量消耗，计算呼吸交换比（RER）和能量消耗（EE），并使用协方差分析（ANCOVA）校正体重。

**研究结果**
**PLX3397高效诱导小胶质细胞耗竭并抑制脑免疫相关功能**
通过免疫荧光分析，PLX3397和PLX5622均导致皮层、纹状体和海马约99%的小胶质细胞消融。但残余小胶质细胞形态存在抑制剂特异性差异：PLX3397处理组残余小胶质细胞胞体面积增大、末端分支减少。脑转录组主成分分析（PCA）显示两组分离，火山图鉴定出小胶质细胞和免疫相关基因（如C1qa、C1qb、P2ry12等）显著下调，GO分析显示下调基因富集于免疫效应过程的调控。这表明两种抑制剂在脑中产生可比的小胶质细胞耗竭和免疫相关转录抑制。

**PLX3397诱导独特的肝脏转录组特征**
肝脏切片免疫染色显示PLX3397和PLX5622均显著减少肝脏窦周巨噬细胞（库普弗细胞）。但PCA分析显示两种抑制剂诱导截然不同的肝脏转录组特征。PLX3397优先上调脂质代谢相关基因（如Ppp1r3g、Lepr、Pnpla3、Fgf21），GO分析显示上调基因富集于脂肪酸代谢和生物合成过程；下调基因富集于免疫相关通路，如细胞趋化、白细胞趋化、抗原加工和递呈及吞噬作用，这些变化可能反映库普弗细胞耗竭。

**PLX3397对异源物代谢影响有限**
与PLX5622广泛诱导异源物代谢三阶段（氧化、结合、转运）酶系不同，PLX3397对该通路影响极小。Western blot证实PLX5622显著诱导CYP2B10、CYP2C37和CYP3A11蛋白表达，而PLX3397处理后这些蛋白表达无明显变化。质谱分析显示，注射戊巴比妥钠1小时后，PLX3397处理组小鼠血浆和肝脏中戊巴比妥浓度与对照组相当。此外，PLX3397对吗啡、尼古丁、可卡因和乙醇代谢相关基因表达影响较小（仅吗啡和尼古丁代谢基因轻度下调）。这表明PLX3397不激活肝脏异源物代谢程序，与PLX5622产生根本不同的肝脏脱靶效应。

**PLX3397诱导时间依赖性肝脏脂质代谢重编程**
通过处理0、3、7、21天的肝脏RNA测序分析，PCA显示PLX3397处理后转录组发生显著时间依赖性偏移。差异表达基因按时间表达模式分为四个簇：簇1（早期抑制后部分恢复）富集脂肪酸代谢和吞噬过程；簇2（短暂早期反应，第3天急剧诱导）富集异源物代谢；簇3（持续免疫激活）富集先天免疫和抗病毒信号；簇4（进行性代谢激活，持续上调至21天）富集有机酸和脂肪酸代谢。这表明PLX3397诱导多阶段肝脏转录重塑，从早期应激和免疫反应进展为持续代谢重编程。

**PLX3397促进肝脏脂肪酸代谢并降低全身脂质水平**
肝脏脂质代谢网络分析显示，PLX3397上调脂肪酸合成基因，下调甘油三酯（TAG）和胆固醇合成基因，并显著上调胆固醇外排基因。生化检测证实PLX3397显著降低血浆TAG、T-CHO和FFA水平，同时升高循环酮体（BHB）水平。在基因性小胶质细胞耗竭模型（iDTR-cKO）中未观察到这些代谢表型，确认脂质变化源自PLX3397的外周脱靶效应。间接测热法显示PLX3397不改变体重、食物摄入或活动量，但显著增加总能量消耗，呼吸交换比（RER）保持稳定。在高胆固醇饮食（HCD）诱导的高脂血症模型中，PLX3397处理显著降低肝脏重量，逆转HCD诱导的肝脏TAG和胆固醇积累。

**讨论与结论**
该研究系统比较了两种广泛使用的CSF1R抑制剂PLX5622和PLX3397的系统性效应。两种化合物均高效耗竭小胶质细胞并产生类似中枢效应，但外周代谢作用显著不同：PLX3397诱导以脂质利用和酮体生成增强为特征的肝脏代谢程序，而PLX5622则激活CAR依赖性异源物代谢。PLX3397诱导的代谢重塑涉及过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）靶基因（如Fabp5、Fgf21、Pdk4、Cpt1a）上调，血浆BHB水平升高，表明其诱导类似禁食的代谢状态。研究结论指出，PLX3397通过独立于小胶质细胞耗竭的机制发挥肝脏脂质代谢重塑效应，增强脂质利用和酮体生成，降低全身脂质水平。该发现揭示了CSF1R抑制先前未被充分认识的系统性代谢后果，强调了在解读小胶质细胞功能时整合药理学和遗传学方法的重要性。