BAMBI：一种基于Ca2+成像的脑机接口用于自由活动小鼠的纵向神经元追踪

《Journal of Neuroscience Methods》：BAMBI: A Ca2+ imaging–based brain–computer interface for longitudinal neuronal tracking in freely behaving mice

　　

脑机接口(BCI)将持续的神经活动转化为实时控制信号，既能支撑基础神经科学实验，也能拓展日益丰富的临床应用。近期，BCI已被应用于啮齿动物以研究海马体等对记忆重要的脑回路中的神经元动态，提供了重要见解。大多数侵入式BCI（包括上述海马体相关研究）利用微电极阵列捕获毫秒级尖峰放电，虽然这些系统以高时间保真度记录动作电位，但随着电极移位或组织反应，信号质量常随时间恶化，使得在数天及以上时间尺度上追踪学习与可塑性背后的神经动态变得复杂。另一种方案是基于Ca2+成像的BCI，利用显微镜通过Ca2+传感器荧光变化检测神经元活动。由于Ca2+成像依赖基因编码指示器，能识别并追踪基因定义的细胞类型，提供每个神经元解剖位置和空间足迹的细胞分辨率图像，从而明确识别多日间相同的大群细胞，并可结合多色成像或光遗传学方法同时读取与操控神经回路。尽管近期进展已实现将Ca2+成像实时处理整合到BCI系统中，但多数应用仍局限于头部固定条件或缺乏实验概念验证。此外，纵向成像研究表明，即使上下文、刺激或行为未改变，神经元表征也会逐渐变化——即“表征漂移”现象。基于Ca2+成像的BCI是否能在多日内高效使用仍不明确。为解决这些挑战，研究人员开发了BAMBI（应用微型显微镜与行为成像的脑机接口），一种为自由活动小鼠纵向记录与分析神经元提供实时反馈的BCI系统。通过在头部固定与自由活动小鼠中追踪海马体神经编码，该BCI系统证明尽管存在表征漂移，通过持续多日激活相同神经元集群仍能实现稳定的奖赏获取。这些结果确立了BAMBI作为一个在复杂自然范式下利用Ca2+成像BCI探测神经可塑性与记忆的平台，补充了敏感但不太稳定的基于电生理的BCI。

研究背景方面，脑机接口(BCI)能将神经活动转化为实时控制信号以服务基础神经科学与临床，但现有多数侵入式BCI依赖微电极阵列记录尖峰放电，存在信号质量随电极移位或组织反应随时间恶化的局限，难以在数天及以上尺度追踪神经元动态与可塑性；而基于Ca²⁺成像的BCI虽可通过基因编码指示器实现细胞分辨率下的同群神经元跨日识别，且能结合多色成像与光遗传学，但目前多限于头部固定条件或缺乏概念验证，同时存在“表征漂移”现象使得其长期有效性不明。为此，研究人员开发BAMBI（Brain-computer interface Applying Mini-microscopes and Behavioral Imaging），一种基于Ca²⁺成像、结合头戴式微型显微镜的BCI系统，用于在自由活动小鼠中实现纵向神经元追踪与实时反馈，并在头部固定声音调制、线性轨道、家笼三类范式中验证其稳定性——即使在存在表征漂移的情况下，无需重训解码器也能维持稳定奖赏获取，证明该系统可作为探测神经可塑性与记忆的平台，补充电生理BCI的不足，相关成果发表于《Journal of Neuroscience Methods》。

关键技术方法上，研究使用11只雄性Thy1-GCaMP6f转基因小鼠（杰克逊实验室株号025393，含C57BL/6、ICR(CD?1)、ICRx17DKimlJ背景，实验开始时4–15月龄，其中2只用于家笼实验为单笼饲养，其余1–3只同笼，均在反向12:12小时光周期下饲养）；通过手术在CA1上方植入玻璃引导管与梯度折射率透镜微内窥镜；利用Inscopix头戴式微型荧光显微镜以6–10 Hz采集Ca²⁺成像，同步行为相机追踪位置；开发Python 3.7面向对象BAMBI软件流水线，实现实时视野对齐、基于预设空间足迹掩码提取ΔF/F荧光迹线、滑动窗口中值滤波去噪、统计阈值Ca²⁺事件检测、模块化模式识别（如两组细胞活性比、边缘细胞同步事件、最大相关位置解码器）及Arduino反馈控制；事后用PCA/ICA或CNMF-E算法、刚性配准与血管标志校正处理数据，通过集合速率相关与群体向量(PV)相关量化表征漂移，用1000次随机细胞组模拟评估机会水平。

研究结果部分，各小节结论如下：

3.1. BAMBI系统架构：BAMBI由头戴式微型荧光显微镜、行为追踪相机与反馈递送系统（如水分配）组成，软件流水线可实现实时神经元与行为数据采集、视野(FOV)对齐、单细胞Ca²⁺迹线提取与事件检测及反馈触发，模块化的硬件与软件可根据实验需求调整。

3.2. 设置流程：BAMBI依靠跨日追踪同一FOV并基于空间坐标与形状识别特定细胞；先用事后算法（PCA/ICA或CNMF-E）生成选定“目标细胞”的空间足迹掩码，会话前将掩码叠加对齐至当前FOV以实现实时荧光提取。

3.3. 实时采集与处理：BAMBI在单帧内（头部固定与线性轨道BCI为10 Hz，家笼BCI为6 Hz）完成图像采集、处理、荧光迹线提取、Ca²⁺事件检测、群体模式识别与反馈递送；实时提取的荧光迹线与事后处理高度相关，线性轨道范式中实时与事后的人群向量(PV)相关也显示位置依赖Ca²⁺事件模式相似，证实实时检测可靠；差异源于实时用固定掩码与预计算基线、因果滑动滤波及简化中位减背景，而事后重估足迹、全会话基线、非因果滤波与显式神经毡减去。

3.4. 头部固定小鼠的声音调制BCI任务：6只小鼠在5–9天会话中通过调节两组海马体细胞活性比控制音调以获取奖赏；行为指标（参与度评分、假舔分数）稳定，尽管集合速率相关显示跨会话表征漂移，但奖赏获取率稳定且显著高于机会水平，会话内BCI激活长度增加反映学习；表明海马体细胞可通过持续激活同一群体在多日维持稳定奖赏获取。

3.5. 自由活动小鼠的BCI：3只小鼠在线性轨道范式中用“边缘细胞”（≥90% Ca²⁺事件在轨道端）控制奖赏；基线与BCI阶段人群向量(PV)相关显示空间表征未重映射，BCI阶段奖赏数因小鼠延长边缘停留而减少但奖赏访问比例稳定，＞90% BCI激活发生在边缘且激活似然比显著＞1，证实激活与空间锁定神经元活动关联，即使存在漂移也无需重训解码器。

3.6. 边缘偏好自发出现诱导神经元活动模式变化：BCI阶段小鼠自发偏好一边缘（停留更长、初期奖赏更多），该边缘真实奖赏数显著超随机模拟机会水平；BCI选定边缘细胞的偏好边缘活动指数(PAI)在BCI阶段显著升高（群体调谐向偏好边缘偏移），而非BCI边缘细胞无此变化，表明BCI训练选择性改变控制神经元空间调谐。

3.7. 自然行为条件下连续月级BCI运行：2只小鼠在家笼环境中基于水端口位置种群模板匹配获取水奖赏；鼠1验证连续3.5天全BCI供水稳定，鼠2在12天固定解码参数（BCI 1）下解码精度与激活率稳定、日饮水量不变；BCI 2阶段提高阈值后激活率下降但恢复阈值即回升、事后模拟固定参数则激活率稳定，证实下降源于阈值而非漂移或记录不稳；探针试验显示目标模板非水端口时激活与奖赏显著减少，证实依赖位置码；表明BAMBI可在自然条件下支持数周慢性BCI应用。

讨论部分总结：研究人员提出BAMBI作为基于Ca²⁺成像的BCI，通过跨日可靠对齐同一FOV追踪个体海马神经元，在三类范式实现多日稳定奖赏获取且无需重训解码器，弥补电生理BCI难长期追踪个体神经元可塑性的不足，首次在自由活动海马体实现数周慢性BCI演示。线性轨道中边缘偏好与选定边缘细胞调谐偏移一致，显示BCI控制神经元可发生选择性重映射；家笼中提高阈值未现进一步学习，可能因小鼠以增加尝试而非精炼神经元模式应对。BAMBI虽限海马体但可推广至运动皮层与顶叶皮层等，局限包括光漂白、Ca²⁺信号慢动力学限制快速事件反馈、临床转化受基因指示器限制及大群体高帧率需计算加速，但未来可扩展光遗传反馈与特定细胞类型靶向，助力自然行为下神经元动态与可塑性研究。

研究结论翻译：研究人员开发了BAMBI，一种基于Ca²⁺成像的BCI，能够在自由活动小鼠中对大群神经元进行纵向记录与实时反馈。通过可靠地跨多会话对齐同一视野(FOV)，BAMBI在多个天内追踪个体海马神经元，为闭环激活保留相同的神经元群体。研究人员通过三个实验范式验证了BAMBI，发现小鼠可以利用BAMBI实现稳定的奖赏获取，表明BCI性能可以在数周内保持稳定而无需重新训练。基于电生理的BCI中经常需要的解码器与受试者频繁重新训练，将此类方法可进行的实验限制在离散会话中，聚焦于相对短时间尺度的学习过程。尽管其中一些系统通过群体水平方法对齐跨日的神经元活动低维流形实现了多日稳定性，但此类方法在群体流形水平上操作，不能保证相同个体神经元随时间驱动解码器，限制了其在个体神经元水平研究长期可塑性的效用。我们的连续家笼范式，据研究人员所知，首次证明了在自由活动条件下海马体中稳健的BCI慢性应用在数周持续时间内的演示。BCI相位期间月级空间解码器的稳定性表明，BCI反馈可以一致地应用于相同编码在扩展的时间尺度上。在线性轨道任务中，研究人员观察到与BCI训练相关的明确行为与生理效应。在线性轨道的BCI阶段，小鼠持续增加其在轨道边缘的访问持续时间，表明它们故意延长在奖赏位点的存在。具体而言，每只小鼠自发地对轨道的一个边缘发展出清晰且持久的偏好——这种不对称性在基线阶段不存在。这种偏好在奖赏与非奖赏访问中都表现出来，在每只动物的所有记录日中持续存在，并且在每只小鼠内具有统计学显著性。重要的是，不同小鼠偏好不同边缘，表明该效应不能归因于实验装置的系统偏差。值得注意的是，这种在线性轨道中的行为变化不会在奖赏在单一位置管理的声音调制与家笼范式中出现。与线性轨道中的这种新兴行为一致，只有选定的BCI边缘细胞（而非其他边缘响应细胞）将其放电转向偏好边缘。这些发现与先前报告一致，即直接参与BCI控制的神经元经历调谐调整。在海马体位置编码背景下，一部分神经元的选择性重映射而其他神经元保持不变，揭示空间图包含异质子群体，与早期工作在虚拟环境中闭环光遗传操作或目标位置锐波涟漪期间显示的个体细胞上下文依赖重映射一致。与此相反，研究人员在家笼实验中没有发现BCI性能在增加任务需求下持续改善的证据。家笼实验中BCI性能在BCI 1期间稳定但在BCI 2期间随着BCI激活阈值收紧的挑战增加而逐渐下降。BCI 2中增加的挑战旨在鼓励出现比BCI 1更接近基线模板模式的神经元活动模式，这将表明超出初始成功率的神经元任务学习。然而，研究人员没有观察到此类学习证据，可能是因为在无约束自由活动条件下小鼠采取了更简单的替代策略以获得足够水量——即进行更多饮水尝试，而非精炼BCI激活所需的神经元模式。研究人员选择海马体作为BAMBI的主要模型，因为它提供特征明确的空间编码（位置细胞），作为自由活动动物BCI激活的自然读出。近期基于电生理的海马体BCI研究提出了重要科学问题，基于Ca²⁺成像的BCI独特地定位在长期与时间尺度及研究人员试图在BCI稳定性背景下研究的表征漂移中解决这些问题，该现象在该区域已被广泛记录。重要的是，BAMBI易于应用于其他脑区，包括先前在头部固定条件下演示过Ca²⁺成像BCI的运动皮层与可研究决策与导航互补问题的顶叶皮层。