基于荧光各向异性的细胞蛋白通用检测方法

《Advanced Science》：Versatile Detection of Cellular Protein via Fluorescence Anisotropy

　　

蛋白质检测是生命科学研究的基石。在此，研究人员提出细胞裂解液荧光各向异性（CFAST），一种通用且易获取的细胞蛋白检测替代方法。CFAST通过测量长寿命triangulenium染料标记的纳米抗体探针的荧光各向异性变化来检测细胞蛋白水平。通过离心和核酸酶孵育等简单步骤去除不必要的细胞成分。研究人员证明CFAST能够稳健地检测细胞中PARP1、MK2和GFP蛋白水平。将小分子孵育和热转移与CFAST结合（热转移-CFAST），可通过定量热稳定化的靶蛋白来检测细胞蛋白-小分子相互作用。热转移-CFAST成功检测到细胞中PARP1和MK2抑制剂以剂量依赖方式结合。高通量热转移-CFAST筛选鉴定出不可成药转录因子SOX2的小分子结合物。该筛选方法还促进了一种双功能PROTAC的开发，该分子同时降解膜结合癌基因EGFR并抑制免疫调节靶点HRH1。CFAST快速，最低仅需2-3小时完成。它操作简单，利用常见实验室设备和价格合理的试剂。研究人员的工作表明，CFAST是一种可行的替代方法，可增强蛋白质检测以及药物和探针发现，具有可扩展、快速和经济的特点。

**论文解读：基于荧光各向异性的细胞蛋白通用检测方法（CFAST）的开发与应用**

**研究背景与问题**
蛋白质检测是生命科学研究的核心环节。传统的蛋白质检测方法如蛋白质印迹法（Western blot）虽应用广泛，但步骤繁琐（包括样品制备、电泳分离、转膜、封闭、抗体孵育、洗涤、检测和灰度分析），耗时长且易引入实验误差，通量较低。质谱（MS）虽可高通量检测蛋白质，但设备昂贵、技术要求高，限制了日常使用。此外，在药物发现领域，检测细胞中蛋白质-小分子相互作用的现有方法存在局限：细胞热转移分析（CETSA）常依赖蛋白质印迹，通量不足；AlphaLISA或荧光素酶（NanoLuc）方法需特定抗体对或遗传修饰；热蛋白质组学（TPP）需专业设备与复杂分析，成本高。因此，亟需一种低成本、可扩展、易操作的替代方法。

**研究内容与结论**
研究人员开发了细胞裂解液荧光各向异性（CFAST）方法，其核心是利用长寿命荧光染料（diazaoxatriangulenium，DAOTA，约20 ns）标记的纳米抗体（VHH）探针，结合核酸酶孵育和离心步骤，在细胞裂解液中直接检测蛋白质水平。CFAST避免了对纯化蛋白的依赖，通过荧光各向异性（FA）变化反映蛋白质含量。研究验证了CFAST可定量内源性PARP1、MK2和GFP，并实现绝对定量（如HeLa细胞中PARP1约0.879 ng/μg裂解液）。进一步，将CFAST与CETSA结合（热转移-CFAST），通过加热使未结合小分子的蛋白变性并离心去除，保留的稳定化蛋白由CFAST定量，从而检测细胞中蛋白质-小分子相互作用。研究证实热转移-CFAST可检测PARP1抑制剂奥拉帕利（olaparib）和MK2抑制剂PF-3644022的剂量依赖性结合。随后，将热转移-CFAST优化为384孔板高通量筛选格式，对约900种已批准药物、活性药物成分和合成化合物进行筛选，针对不可成药转录因子SOX2和膜结合癌基因EGFR。筛选发现wedelolactone为SOX2新结合物（表面等离子共振验证Kd为5.54 μM），以及desloratadine为EGFR新结合物（荧光偏振验证IC50约677 nM）。基于desloratadine，研究人员开发了双功能PROTAC（E151和E152），同时降解EGFR并抑制组胺受体H1（HRH1）。E151和E152在A431细胞中展示出EGFR降解活性（DC50分别为94.4 nM和8.63 nM），并通过泛素-蛋白酶体系统作用。此外，PROTACs保留HRH1抑制活性，能降低M2型巨噬细胞中免疫检查点VISTA水平，并抑制钙离子动员，将M2型巨噬细胞重编程为M1型。该工作发表于《Advanced Science》。

**关键技术与方法**
1. **荧光各向异性（FA）理论建模**：基于Perrin方程模拟荧光寿命对分子量依赖性的影响，选择长寿命染料DAOTA（约20 ns）以提升检测动态范围。
2. **DAOTA标记纳米抗体探针合成**：通过马来酰亚胺或NHS酯化学连接将DAOTA染料与靶向PARP1、MK2、GFP或MYC标签的纳米抗体（VHH）结合。
3. **CFAST操作流程**：细胞冻融裂解，核酸酶（UltraNuclease）消化核酸降低粘度，离心去除不溶物，上清与探针孵育后测量FA（激发530/25 nm，发射590/35 nm）。
4. **热转移-CFAST**：活细胞与小分子共孵育2小时，加热至靶蛋白特异性温度使未结合蛋白变性，离心后上清中稳定化蛋白由CFAST定量。
5. **高通量筛选**：384孔板格式，每孔1×10^6细胞，处理约900种化合物（5种为一池），FA读板检测，阳性池进一步单药验证。
6. **表面等离子共振（SPR）**：Biacore 8K，重组SOX2固定于CM5芯片，验证wedelolactone结合。
7. **PROTAC化学合成**：基于desloratadine弹头与泊马度胺（pomalidomide）E3连接酶配体，通过酰胺键连接合成E151和E152。
8. **巨噬细胞分化与钙离子动员实验**：THP-1细胞经PMA分化后，IFN-γ/LPS诱导M1型，IL-4/IL-13诱导M2型；Fluo-4检测钙离子浓度。

**研究结果**
**2.1 长寿命荧光染料标记纳米抗体探针可检测细胞蛋白水平**
通过Perrin理论模拟，DAOTA标记纳米抗体探针在检测200-300 kDa蛋白时具有更优动态范围。体外实验显示DAOTA-纳米抗体与重组MK2结合后FA显著变化，而抗体探针无变化。针对PARP1和MK2的探针表现特异性。在裂解液体系中，加入核酸酶孵育可降低背景FA，使检测可行。

**2.2 CFAST可定量绝对细胞蛋白**
CFAST在HEK293T细胞中检测GFP、PARP1和MK2的蛋白水平变化，与蛋白质印迹结果一致。FITC标记探针因寿命短（4 ns）无法区分PARP1敲除（KO）与野生型，而DAOTA探针成功区分。通过重组PARP1标准曲线，实现HeLa细胞中PARP1绝对定量（0.879±0.081 ng/μg裂解液），与质谱文献一致。

**2.3 CFAST结合热稳定性可检测细胞蛋白-小分子相互作用**
热转移-CFAST在HEK293T细胞中检测到奥拉帕利与PARP1的剂量依赖性结合，温度梯度实验验证稳定性增加。六种PARP1抑制剂均被检测，与CETSA蛋白印迹结果一致。MK2过表达细胞中，PF-3644022同样被检测到剂量依赖性结合。

**2.4 CFAST筛选鉴定不可成药转录因子SOX2的小分子结合物**
对表达MYC标签SOX2的HEK293T细胞，用MYC标签纳米抗体探针进行高通量筛选。从900种化合物中鉴定出wedelolactone为SOX2结合物，SPR验证Kd=5.54 μM，CETSA证实其在H69细胞中稳定内源性SOX2。

**2.5 CFAST筛选鉴定膜结合癌基因EGFR的小分子结合物**
类似筛选策略，鉴定出desloratadine为EGFR新结合物，荧光偏振验证IC50≈677 nM，CETSA证实其稳定EGFR。

**2.6 开发双功能EGFR/HRH1靶向工具化合物**
基于desloratadine弹头合成PROTACs E151和E152，在A431细胞中剂量依赖性降解EGFR（DC50分别为94.4 nM和8.63 nM），且降解通过泛素-蛋白酶体途径（被MG132和MLN4924抑制）。细胞活力实验显示对EGFR高表达细胞系（A431、HCT116）有抑制作用。E151不降解HRH1，但抑制HRH1活性（钙离子动员实验），并降低M2型巨噬细胞中VISTA表达及M2标志物（IL-10、MCP1、ARG），促进M1型转化。

**讨论与结论**
CFAST通过FA实现细胞蛋白定量，无需大量纯化。其模块化设计（纳米抗体可针对不同蛋白）扩展了FA的应用范围。热转移-CFAST适用于不可成药靶点（如SOX2、EGFR）的配体发现，并促进PROTAC开发。方法简易、成本低（384孔板每样品约0.2美元），便于推广。局限性：低丰度蛋白检测可能受限，需提高染料标记效率；荧光化合物可能干扰；热转移-CFAST更适合单/少数靶点的大规模筛选，而非全蛋白质组。结论：CFAST提供了一个基于FA的多功能平台，可替代蛋白质印迹进行快速蛋白定量，结合热转移可高通量检测细胞蛋白-小分子相互作用，有望促进配体发现和PROTAC开发，尤其针对传统方法难以处理的靶点。