年轻成年期小胶质细胞C1q缺失减少突触吞噬并在侵袭性阿尔茨海默病小鼠模型中部分缓解认知障碍

《GLIA》：Young Adult Microglial Deletion of C1q Reduces Engulfment of Synapses and Partially Mitigates Cognitive Impairment in an Aggressive Alzheimer's Disease Mouse Model

　　

C1q是一种多功能蛋白，包括作为经典补体级联反应的起始蛋白。尽管经典途径激活参与神经系统发育过程中的突触修剪，但它也促进阿尔茨海默病（AD）中的炎症和认知衰退。组成性遗传C1q缺陷已被证明可减少AD小鼠模型中的胶质细胞激活并减轻神经元损失，但小胶质细胞C1q对AD病理的特异性贡献，同时避免出生后发育缺陷，仍未得到解决。为了剖析小胶质细胞C1q在AD进展中的特定作用，研究人员将Cx3cr1^CreERT2小鼠模型（该模型在年轻成年期（8周龄）从小胶质细胞中删除C1q）与侵袭性Arctic48（Arc）淀粉样变性小鼠模型杂交。在10月龄时，年轻成年期小胶质细胞C1q缺失（Arc C1q^ΔMG）与空间记忆表现的改善相关，尽管淀粉样蛋白斑块负荷未改变。此外，Arc C1q^ΔMG小鼠表现出海马C3蛋白水平降低，而C3 mRNA未改变。未观察到C5aR1、星形胶质细胞GFAP或小胶质细胞Iba1蛋白表达的变化。然而，Arc C1q^ΔMG小鼠在小胶质细胞突触吞噬方面表现出区域特异性减少，同时小胶质细胞和星形胶质细胞中吞噬溶酶体相关的淀粉样蛋白减少，以及海马淀粉样蛋白致密化降低。这些发现支持C1q在星形胶质细胞C3诱导以及突触和淀粉样蛋白吞噬中的作用。重要的是，年轻成年期小胶质细胞C1q抑制在不加剧淀粉样蛋白病理的情况下带来认知获益，提示存在一个治疗窗口，其中靶向小胶质细胞C1q可能有助于在AD后期阶段维持突触完整性并调节神经炎症过程。

### 论文解读：小胶质细胞C1q缺失在阿尔茨海默病模型中的突触保护与认知改善作用

#### 研究背景与问题

阿尔茨海默病（AD）是最常见的老年痴呆症，其神经病理特征包括细胞外β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成的淀粉样斑块、细胞内过度磷酸化tau蛋白形成的神经原纤维缠结，以及突触丢失。近年来，神经炎症和先天免疫激活在AD进展中的关键作用日益受到关注，其中补体系统（尤其是经典补体途径）成为研究热点。全基因组关联研究（GWAS）已将多个补体成分（如CLU和CR1）与AD易感性相关联，且许多补体因子在人类和小鼠脑组织中的纤维状Aβ（fAβ）斑块处共定位。

经典补体途径以C1q为识别成分，C1q作为多功能的起始蛋白，通过与IgG/IgM的Fc区、损伤相关分子模式（DAMP）、凋亡细胞等结合而激活C1复合物，进而生成C3a、C3b以及下游终末产物C5a和C5b-9。C1q在发育过程中参与突触修剪（Stevens et al., 2007），在成年稳态脑中参与突触可塑性，但C1q表达随年龄、损伤和疾病而增加。在AD中，C1q和C3的激活被认为是突触丢失和认知障碍的机制之一，组成性敲除C1q可在tau蛋白病和淀粉样变性小鼠模型中恢复突触密度并减轻病理。

然而，C1q在中枢神经系统（CNS）中几乎仅由小胶质细胞产生（Fonseca et al., 2017），但小胶质细胞来源的C1q在AD进展中的具体贡献尚不清楚。此前使用组成性敲除模型的研究由于C1q在发育和稳态中的已知功能，其解释受到限制。因此，需要一种在成年期特异性删除小胶质细胞C1q的方法，以评估其在AD后期病理中的作用，同时避免发育期干扰。

#### 研究内容与结论

研究人员利用Cx3cr1^CreERT2敲入小鼠（在8周龄时独立于他莫昔芬处理实现小胶质细胞C1q删除）与侵袭性Arctic48（Arc）淀粉样变性小鼠模型杂交，构建了Arc C1q^ΔMG小鼠。在10月龄时，通过行为学、免疫荧光、Western blot、qPCR、MSD等多种技术，系统评估了小胶质细胞C1q缺失对认知功能、淀粉样蛋白病理、补体成分表达、小胶质细胞和星形胶质细胞突触吞噬及淀粉样蛋白吞噬的影响。

**主要结论**：年轻成年期小胶质细胞C1q删除可部分改善Arc小鼠的空间记忆障碍，减少海马C3蛋白水平（而非C3 mRNA），在CA1区（而非CA3区）显著减少小胶质细胞溶酶体对兴奋性突触（Vglut1）的吞噬，并降低小胶质细胞和星形胶质细胞中溶酶体相关的Aβ吞噬，同时增加平均淀粉样斑块大小，但未改变整体斑块负荷、小胶质细胞Iba1和星形胶质细胞GFAP的表达以及C5aR1的水平。这些发现表明C1q在星形胶质细胞C3诱导以及突触和Aβ的吞噬中发挥作用，且靶向小胶质细胞C1q可能在不加剧淀粉样蛋白病理的情况下，通过减少补体下游炎症信号和异常突触修剪来改善认知。

**重要意义**：该研究首次在AD模型中实现了成年期小胶质细胞特异性C1q缺失，揭示了C1q在疾病后期阶段对突触完整性和神经炎症的贡献，为AD治疗提供了以C1q为靶点的时间窗口参考，提示过早在疾病早期抑制C1q可能有害，而后期干预可能获益。

#### 主要关键技术方法

1. **动物模型构建**：利用Cx3cr1^CreERT2小鼠（在8周龄实现他莫昔芬非依赖性小胶质细胞C1q删除）与Arctic48（Arc）APP转基因小鼠杂交，获得Arc C1q^ΔMG小鼠及其对照。所有小鼠来自美国加州大学尔湾分校的动物设施。
2. **行为学测试**：采用物体位置记忆（OLM）任务评估海马依赖性空间记忆，同时通过旷场实验监测运动能力和焦虑水平。
3. **免疫荧光与共聚焦成像**：使用多种抗体（包括Iba1、CD68、Vglut1、GFAP、C3、C5aR1、6E10、Lamp2等）结合Thioflavin S或AmyloGlo染色，在Leica Sp8共聚焦显微镜下采集图像，利用Imaris 10.0进行三维重建和定量分析，包括突触吞噬（Vglut1与小胶质细胞/溶酶体共定位）和胶质细胞Aβ吞噬（6E10与Iba1/GFAP及CD68/Lamp2共定位）。
4. **分子生物学检测**：通过Western blot验证C1q蛋白水平，qPCR检测C3、C4、C5aR1的mRNA表达，MesoScale Discovery（MSD）技术定量可溶性和不溶性Aβ₄₀和Aβ₄₂。

#### 研究结果

**3.1 年轻成年期C1q小胶质细胞缺失部分缓解Arc小鼠认知障碍**
通过旷场实验发现Arc小鼠运动距离减少，而Arc C1q^ΔMG小鼠得到改善（p<0.05）。在OLM测试中，Arc小鼠表现出显著的空间记忆缺陷（p<0.01 vs WT），Arc C1q^ΔMG小鼠的认知缺陷减轻（效应量Cohen's d=-0.987，p=0.057），接近统计学显著。

**3.2 淀粉样蛋白病理和血浆NfL不受年轻成年期小胶质细胞C1q缺失影响**
Thioflavin S染色显示Arc C1q^ΔMG与Arc小鼠海马纤维状Aβ负荷无差异，但平均斑块大小增加21%（p<0.04）。MSD分析表明可溶性和不溶性Aβ₄₀、Aβ₄₂均无变化。血浆神经丝轻链（NfL）在7月龄时Arc小鼠有升高趋势，Arc C1q^ΔMG小鼠未升高，但10月龄时两组均升高，提示C1q缺失仅暂时抑制NfL升高。

**3.3 年轻小胶质细胞C1q缺失降低Arc小鼠脑内C3水平，但小胶质细胞Iba1、星形胶质细胞GFAP和C5aR1表达不受影响**
免疫荧光显示Arc小鼠海马C3和GFAP表达升高，Arc C1q^ΔMG小鼠C3体积减少38%（p<0.01），GFAP仅趋势性降低10%（p=0.08）。C5aR1和Iba1表达在Arc和Arc C1q^ΔMG之间无差异。

**3.4 小胶质细胞C1q缺失不改变Arc海马中特定补体基因的转录**
qPCR结果显示C3、C4、C5aR1的mRNA水平在Arc和Arc C1q^ΔMG海马中无差异，提示C3蛋白降低发生在翻译或翻译后水平。

**3.5 小胶质细胞C1q缺失减少Arc小鼠CA1区的突触吞噬**
在CA1区，Arc小鼠小胶质细胞对Vglut1的关联（Iba1-Vglut1共定位）增加，但C1q缺失未显著改变该共定位；然而，溶酶体相关Vglut1（CD68-Vglut1共定位）在Arc C1q^ΔMG小鼠中减少37%（p<0.05）。在CA3区，Arc小鼠溶酶体相关Vglut1增加，但C1q缺失未显著减少。CD68体积在CA1区有36%的趋势性降低（p=0.06）。Vglut1 puncta数量在Arc CA1区减少，C1q缺失后恢复。

**3.6 年轻成年期小胶质细胞C1q缺失减少小胶质细胞对淀粉样蛋白的吞噬**
在Arc C1q^ΔMG小鼠中，小胶质细胞与Aβ的关联（Iba1-6E10共定位）无变化，但溶酶体相关Aβ（Iba1-CD68-6E10共定位）减少50%（p<0.05），CD68体积有53%的趋势性降低（p=0.058），而Iba1体积和6E10体积无变化。

**3.7 年轻成年期小胶质细胞C1q缺失减少星形胶质细胞对淀粉样蛋白的吞噬，但不改变星形胶质细胞与斑块的相互作用**
星形胶质细胞与Aβ的关联（GFAP-6E10共定位）无差异，但溶酶体相关Aβ（GFAP-Lamp2-6E10共定位）在Arc C1q^ΔMG小鼠中减少35%（p<0.05），Lamp2体积有33%的趋势性降低（p=0.069）。GFAP体积和6E10体积无变化。

#### 讨论与结论总结

**讨论部分总结**：该研究证明年轻成年期小胶质细胞C1q缺失在淀粉样变性小鼠模型中可改善认知功能、减少突触修剪并降低星形胶质细胞C3表达，而对整体淀粉样蛋白负担影响甚微。这支持了免疫反应（而非淀粉样蛋白本身）是AD突触丢失和认知下降驱动因素的假说。与组成性C1q敲除研究（Fonseca et al., 2004）相比，本研究中胶质细胞标记物Iba1和GFAP未改变，说明这些标记物不能完全反映功能激活状态。研究观察到CA1区而非CA3区的突触吞噬减少，可能与海马亚区对AD病理的易感性差异有关。C3蛋白降低而mRNA未变，提示翻译后调控。C1q缺失导致斑块增大，支持C1q参与淀粉样蛋白致密化。小胶质细胞和星形胶质细胞中溶酶体相关Aβ减少，可能反映C1q作为调理素或通过MerTK/Megf10途径影响吞噬。C5aR1表达未变，但下游C5a生成减少可能减轻炎症。局限性包括：Arc模型不完全模拟人类AD、Cx3cr1表达于其他脑巨噬细胞、仅研究兴奋性突触等。此外，C1q在AD早期可能具有神经保护作用，因此治疗时机至关重要。

**结论部分翻译**：总之，这项工作为补体介导的神经炎症的时间动力学提供了重要见解，并强调了在阿尔茨海默病中靶向C1q的潜力。由于先前研究已证明C1q具有独立于补体级联的神经保护作用和信号机制，因此必须开展未来研究，检验小胶质细胞C1q在AD不同阶段的作用。如果C1q在AD早期确实具有神经保护作用，那么在疾病进展过早阶段使用抗C1q治疗可能会恶化认知表现。最后，理解跨细胞类型的C1q响应受体网络（Benavente et al., 2020）对于制定针对C1q的全面治疗策略至关重要。