GW9508诱导的胸腺上皮细胞中GPR40的激活：一种延缓胸腺衰老的治疗策略

《Aging Cell》：GW9508-Induced Activation of GPR40 in Thymic Epithelial Cells: A Therapeutic Strategy to Delay Thymic Aging

　　

与年龄相关的胸腺退化导致T细胞产生减少，这是免疫衰老（immunosenescence）的主要原因，从而增加对癌症、感染和自身免疫性疾病的易感性。对于T细胞发育至关重要的胸腺上皮细胞（thymic epithelial cells，TECs）随年龄增长表现出进行性衰老。开发缓解TECs衰老并延缓胸腺退化的策略已成为一个重要研究焦点。本研究采用了老年C57BL/6J小鼠和永生化的胸腺上皮细胞（immortalized thymic epithelial cells，iTECs）。研究人员在老年小鼠的TECs和阿霉素（doxorubicin）体外诱导的衰老iTECs中观察到GPR40表达的显著降低。对老年小鼠或衰老iTECs给予GPR40激动剂GW9508、拮抗剂GW1100或其组合，结果证明GPR40激活有效恢复了老年小鼠的胸腺功能。机制上，GW9508靶向GPR40以升高细胞内钙离子（Ca²⁺）水平，从而激活AMPK信号通路（AMP-activated protein kinase signaling pathway）并抑制衰老细胞中ERK1/2-MAPK通路（extracellular signal-regulated kinase 1/2 - mitogen-activated protein kinase pathway）的过度激活，最终增强衰老iTECs的活性。综上，这些发现表明，通过GW9508对GPR40的外源性激活可能是一种缓解老年个体胸腺衰老并增强免疫功能的可行策略。

**研究背景与问题**
胸腺在T细胞发育和细胞免疫建立中起关键作用。胸腺上皮细胞（TECs）是胸腺中主要基质细胞，维持胸腺结构与功能。随年龄增长，胸腺发生渐进性退化（thymic involution），表现为体积减小、TECs数量下降、成纤维细胞和脂肪细胞积聚，导致初始T细胞生成减少及外周T细胞受体（TCR）多样性降低，引发免疫衰老（immunosenescence），增加感染、肿瘤和自身免疫性疾病风险。减轻TECs衰老并延缓胸腺退化成为研究重点。GPR40（游离脂肪酸受体1，FFAR1）在代谢疾病和老年相关疾病中受关注，但其在衰老TECs中的角色尚未明确。GW9508是GPR40选择性激动剂，通过Gαq亚基升高细胞内钙离子水平。本研究旨在探讨GW9508激活GPR40能否延缓胸腺衰老及其分子机制。论文发表在《Aging Cell》。

**主要技术方法**
研究采用老年C57BL/6J小鼠（17月龄，雌性）及永生化的胸腺上皮细胞（iTECs）（来自浙江中医药大学Jian-Li Gao实验室）。主要技术包括：腹腔注射给药（GW9508及拮抗剂GW1100）、器官指数计算、细胞培养与阿霉素（DOX）诱导衰老模型、CCK-8细胞活力检测、Western blot蛋白表达分析、实时定量RT-qPCR（qRT-PCR）、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色、流式细胞术（分析胸腺细胞亚群、TECs亚群、脾脏及外周血T细胞亚群、细胞内钙离子水平、细胞凋亡）、免疫荧光染色（胸腺冷冻切片）、细胞转染（siRNA敲低和质粒过表达）。

**研究结果**
**3.1 GW9508增加了老年小鼠的胸腺指数**
与溶剂对照组（DMSO）相比，GW9508处理（12.5和25 mg/kg）显著增大了胸腺大小和胸腺指数，且肝肾功能未见毒性（AST、ALT无显著改变，尿素和肌酐水平下降）。GW1100（GPR40拮抗剂）共处理逆转了胸腺指数的增加，提示GW9508通过GPR40减轻年龄相关胸腺萎缩。

**3.2 GW9508延缓胸腺退化并促进老年小鼠T淋巴细胞再生**
流式细胞术显示，GW9508显著增加了胸腺中双阴性（DN）、双阳性（DP）、CD4⁺单阳性（SP）和CD8⁺ SP细胞数量，并促进DN各亚群（DN1-DN4）分化。GW9508还提高了总TECs、髓质TECs（mTECs）和皮质TECs（cTECs）数量，增加了MHC II^hi和CD80^hi TECs比例，以及Ki67⁺ cTECs、Ki67⁺ mTECs和Aire⁺ mTECs的数量，表明增殖和抗原提呈能力增强。在脾脏中，GW9508增加了CD3⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞以及多种功能亚群（包括效应记忆、中央记忆、初始T细胞和近期胸腺迁出细胞RTE）的数量，尤其提高了CD8⁺初始T细胞频率。外周血中亦观察到类似改善。GW1100拮抗了这些效应。

**3.3 GW9508增强了衰老iTECs的活力**
DOX诱导的衰老iTECs中，GW9508（1.2、2.4、4.8 μM处理72 h）以剂量依赖性方式恢复细胞活力，减少SA-β-Gal阳性细胞比例（从~85%降至约20%），并抑制衰老标志物P21表达。GW9508上调了增殖相关基因（CyclinD1、FgfR2IIIb、CD40）和FoxN1相关靶基因（Ccl25、Dll4、Kit L）以及抗凋亡基因Survivin的表达，增加了Ki67和Aire的蛋白水平。流式细胞术显示GW9508提高了cTECs比例及CD80和MHC II分子表达。此外，GW9508增加衰老iTECs的总凋亡率（Annexin V/7-AAD染色），提示其具有促衰老细胞清除的senolytic作用。

**3.4 GW9508激活GPR40调控信号通路，GW1100逆转其效应**
Western blot显示衰老iTECs中GPR40表达降低，而GW9508处理使其恢复。免疫荧光染色证实胸腺中GPR40表达随年龄下降。GW9508升高了衰老iTECs中细胞内钙离子水平，并激活AMPK通路（p-AMPKα1/2↑），同时抑制ERK1/2-MAPK通路（t-ERK1/2和p-ERK1/2↓），增加下游增殖蛋白CyclinD1和CREB1表达。使用AMPK抑制剂compound C阻断AMPK后，ERK1/2-MAPK的抑制被解除，表明AMPK位于ERK1/2-MAPK上游。GW1100共处理显著减弱了钙离子升高、AMPK激活、ERK1/2-MAPK抑制以及功能基因蛋白上调，并增加P21表达，证实GW9508通过GPR40发挥作用。

**3.5 GPR40敲低促进细胞衰老，GPR40过表达缓解细胞衰老**
在年轻iTECs中通过siRNA敲低GPR40，抑制了AMPK通路、加重ERK1/2-MAPK异常激活、下调功能基因蛋白、升高P21，模拟了衰老表型。在衰老iTECs中过表达GPR40（pcDNA3.1-GPR40），则激活AMPK、抑制ERK1/2-MAPK、上调功能相关基因蛋白并降低P21，与GW9508效果一致，进一步证实GPR40介导抗衰老作用。

**讨论与结论**
讨论部分总结了胸腺衰老与免疫衰老的关系，指出GW9508通过激活GPR40、升高钙离子、激活AMPK并抑制ERK1/2-MAPK通路，减轻TECs衰老并恢复胸腺功能。研究还强调需要年轻对照组和脾脏组织病理学评估作为未来改进方向。研究结论：GW9508通过外源性激活GPR40，激活AMPK信号通路并抑制ERK1/2-MAPK通路，从而增强衰老iTECs的活力并恢复其功能。体内实验证实GW9508有效恢复老年小鼠胸腺功能并促进结构恢复。这些发现揭示了GW9508的抗衰老特性，为其作为抗胸腺衰老治疗策略提供了新见解和药理基础。