空间分辨单细胞图谱揭示血脑屏障完整性是胶质瘤中巨噬细胞和小胶质细胞定位与功能状态的中枢调节因子

《Neurobiology of Disease》：A spatially resolved single-cell atlas identifies blood-brain barrier integrity as a central regulator of macrophages and microglia localization and functional states in gliomas

　　

鉴于胶质瘤相关巨噬细胞和小胶质细胞（Glioma-Associated Macrophages and Microglia，GAMs）在肿瘤演化中起关键作用，研究人员旨在定义其与磁共振成像（MRI）定义的血脑屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）完整性相关的空间分布和功能重编程。12名患者接受了MRI引导下的取样，从40个增强区域和25个非增强区域获得65份活检样本。单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq）生成了高分辨率细胞图谱，研究人员分析了与解剖区域和增强状态相关的细胞组成、转录程序、巨噬细胞极化和转录亚型分布。研究人员分析了5445个细胞，鉴定了9个主要细胞群体。巨噬细胞富集于肿瘤和增强区域，而小胶质细胞主要分布于瘤周和非增强区域。增强区域的肿瘤细胞表现出生长主导的合成代谢状态，而非增强和瘤周区域的肿瘤细胞保留了神经元发育和突触组织程序。GAMs表现出区域特异性功能极化：瘤周和非增强区域的巨噬细胞富集于神经发育和组织重塑程序，而肿瘤和增强区域的巨噬细胞激活了趋化、炎症和免疫调节通路。与转录亚型的整合分析揭示了间充质（Mesenchymal）/经典型（Classical）程序与增强区域以及前神经元型（Proneural）特征与非增强区域的空间耦合，强调了显著的瘤内空间镶嵌性。MRI定义的BBB通透性在空间上组织了一个胶质瘤生态系统，其中肿瘤代谢和巨噬细胞状态紧密耦合，深化了对免疫微环境的理解，并为空间指导的免疫治疗提供了理论基础。

### 论文解读：空间分辨单细胞图谱揭示血脑屏障完整性对胶质瘤中巨噬细胞和小胶质细胞定位与功能状态的中枢调节作用

#### 研究背景与现存问题

胶质瘤，尤其是胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM），预后极差，尽管手术、放化疗及替莫唑胺等标准治疗手段不断改进，患者中位总生存期仍仅约14–18个月。近期针对新发或复发GBM的免疫检查点阻断随机III期临床试验也未能显著改善生存，凸显胶质瘤对现有免疫治疗策略的内在抵抗性。这种不利结局主要源于中枢神经系统的独特解剖位置及其特化的免疫环境，限制了药物递送、免疫细胞浸润及持续的抗肿瘤免疫反应。在胶质瘤肿瘤微环境中，胶质瘤相关巨噬细胞和小胶质细胞（Glioma-Associated Macrophages and Microglia，GAMs）是主要的免疫细胞群体，被普遍认为是肿瘤演化和进展的中枢调节因子。GAMs可促进肿瘤细胞增殖、侵袭、血管生成和代谢适应，同时抑制细胞毒性T细胞活性和抗原呈递，从而促进免疫逃逸和治疗抵抗。然而，GAMs存在显著异质性，反映其不同的发育起源（小胶质细胞源于胚胎卵黄囊，巨噬细胞源于循环单核细胞）和多样的转录及功能状态。血脑屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）通透性可通过对比增强磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）无创评估，增强与非增强区域的血管、代谢和免疫特征截然不同，提示BBB状态可能作为GAM招募和表型的关键空间调节因子。但现有研究多基于批量转录组学或有限空间取样，难以捕捉细胞类型特异性表型和BBB破坏导致的区域免疫异质性。因此，需进行与BBB通透性关联的综合性、空间解析的GAM表征。

#### 主要关键技术方法

本研究采用了整合空间转录组学框架，结合MRI导航多点活检与单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）。样本来源于中国胶质瘤基因组图谱（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA）队列的12例患者（10例GBM、2例少突胶质瘤及1例脑转移瘤），共获取65份活检标本（40份增强区域、25份非增强区域）。通过术前MRI（T2加权及对比增强T1加权）对活检靶点进行放射学分类（增强区、非增强浸润边缘、瘤周水肿区），并利用神经导航系统进行立体定向标本采集。scRNA-seq文库基于修改的STRT-seq方案构建，在Illumina HiSeq 4000平台测序。数据分析使用Seurat v3.2.0进行标准化、降维（主成分分析）及一致性聚类（Harmony整合），并通过单样本基因集富集分析（single-sample Gene Set Enrichment Analysis，ssGSEA）评估M1/M2样极化状态。

#### 研究结果

**3.1 样本采集与空间分辨单细胞分析**
研究人员通过重新分析既往发表的scRNA-seq数据集，经质控和标志基因注释后获得5445个高质量单细胞，鉴定出9个主要细胞群体，包括恶性肿瘤细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、T细胞、中性粒细胞、少突胶质细胞、神经元、纤毛上皮细胞及少量肺相关细胞。单细胞转录组分析显示不同区域间的瘤间及瘤内异质性显著。

**3.2 空间及MRI增强相关细胞组成重塑**
巨噬细胞主要富集于肿瘤区域，尤其在对比增强（CE）区域；小胶质细胞则更多分布于瘤周和非增强（NE）区域。这一空间分离反映了BBB通透性对髓系亚群招募的关键决定作用。

**3.3 GAM组成与胶质瘤转录亚型相关**
仅对GBM病例分析发现，肿瘤区域富集间充质（Mesenchymal）和经典型（Classical）转录程序，而瘤周及正常区域显示较高比例的前神经元型（Proneural）和正常样（Normal-like）特征。瘤内不同空间区域常呈现不同的亚型组成，表明单一病灶内多种转录亚型共存，显示显著的瘤内空间镶嵌性。

**3.4 区域特异性GAM生物学过程及极化揭示功能异质性**
肿瘤细胞在瘤周和正常区域富集神经元发育、突触组织通路；在肿瘤区域则显著富集核糖体生物合成、RNA加工及mTORC1信号通路等合成代谢程序。非增强区域肿瘤细胞保留神经元分化相关程序，增强区域则呈现癌基因及生长相关程序激活。

**3.5 TAMs的空间及MRI增强相关功能重编程**
巨噬细胞在肿瘤区域呈现更高的M2样极化比例（免疫抑制），而瘤周及正常区域相对富集M1样状态。瘤周巨噬细胞高表达神经发育相关基因，肿瘤巨噬细胞则上调炎症趋化因子及抗原呈递相关基因。增强区域巨噬细胞呈M2样极化增加，并富集迁移、免疫调节及慢性炎症反应通路；非增强区域巨噬细胞保留神经发育及稳态功能特征。

#### 讨论与结论总结

讨论部分指出，本研究的核心发现是MRI增强并非简单的肿瘤负荷影像学替代指标，而是对应于恶性及免疫区室的协调生物学状态。增强区域一致地富集恶性细胞、间充质/经典型转录程序及合成代谢信号，而非增强及瘤周区域保留更分化、神经样肿瘤细胞状态。研究揭示了显著的瘤内分子可塑性：转录亚型在单个肿瘤内以空间组织形式共存，区域微环境动态塑造亚型身份。免疫区室，特别是肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages，TAMs），是空间异质性的主要驱动因素：肿瘤和增强区域巨噬细胞向免疫抑制性M2样极化，伴随迁移、炎症及免疫调节程序激活；瘤周和非增强区域巨噬细胞则保留神经发育和稳态功能。研究还发现巨噬细胞优先聚集于BBB破坏区域，而小胶质细胞更显著地浸润于瘤周水肿带而非增强核心，且其丰度在瘤周水肿与正常脑实质之间、GBM与低级别胶质瘤之间无显著差异，提示小胶质细胞在瘤周区域的积累可能反映对病灶周围微环境扰动的保守性反应。

**研究结论**：本研究提供了一个概念框架，将MRI表型与胶质瘤的细胞、分子及功能异质性联系起来。通过将影像学特征锚定于明确的肿瘤和免疫状态，研究结果具有直接转化意义，包括改进影像解读、优化活检策略以及合理设计空间靶向治疗干预。未来需整合纵向影像、空间转录组学及治疗反应数据，以阐明这些空间程序在治疗压力下的动态演变。