FRRS1L基因替代改善发育性和癫痫性脑病37小鼠模型的疾病表型

《Neurotherapeutics》：FRRS1L gene replacement ameliorates disease phenotypes in the mouse model of developmental and epileptic encephalopathy 37

　　

基因治疗为治疗罕见遗传性疾病（例如DEE37，一种由铁螯合物还原酶1样蛋白（FRRS1L）基因双等位基因功能缺失突变引起的严重发育性和癫痫性脑病，表现为癫痫发作、发育迟缓、运动障碍、共济失调以及进行性、最终导致衰弱的认知和运动损伤）提供了独特的治疗潜力。目前尚无针对DEE37的治疗方法。FRRS1L编码一种辅助亚基，对于α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体（AMPARs）的四聚体组装及其向突触膜的募集至关重要。FRRS1L在全脑表达，在小脑中水平较高。在此，研究人员开发了一种腺相关病毒9型（AAV9）基因替代载体，由JeT启动子驱动表达人FRRS1L。通过鞘内给药（剂量分别为5 × 10¹⁰和3 × 10¹¹ vg）给Frrs1l基因敲除小鼠，研究人员在多项与患者共享的表型特征中评估了安全性和有效性。研究人员在小脑中获得了稳健、接近正常的FRRS1L表达，而在大脑其他区域表达水平较低，这与突触AMPAR丰度相应水平的增加相关。重要的是，研究人员的表型评估显示，在多个脑结构、皮层电图和行为领域中存在剂量依赖性的改善趋势或挽救。研究人员的这些结果表明，脑脊液导向的病毒介导的FRRS1L基因替代部分恢复了突触AMPAR，并改善了疾病相关表型，支持基因治疗作为针对患有这种灾难性FRRS1L相关第37型DEE的儿童的一种有前景的治疗策略。

**论文解读：FRRS1L基因替代治疗在发育性和癫痫性脑病37小鼠模型中的疗效评估**

**研究背景与问题**
发育性和癫痫性脑病37（DEE37）是一种由铁螯合物还原酶1样蛋白（FRRS1L）基因双等位基因功能缺失突变引起的罕见且严重的遗传性疾病。患者通常在婴幼儿期出现正常发育或轻度延迟，但在6至24个月间开始出现多种癫痫发作类型，随后发生显著退行性改变，导致严重发育迟缓、智力残疾、语言缺失、复杂运动障碍（如舞蹈症、运动障碍、共济失调）以及进行性的认知和运动损伤。脑电图（EEG）上常见高度失律，并进展为其他难治性癫痫综合征。影像学上，患者随着病程发展可出现进行性皮质、小脑和尾状核萎缩。目前，DEE37尚无有效治疗方法。FRRS1L蛋白主要在中枢神经系统（CNS）表达，尤其是在小脑中高度表达。该蛋白作为α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体（AMPARs）的关键伴侣，参与其在内质网中的正确组装及其向突触膜的运输。FRRS1L缺失导致AMPAR在突触的显著减少，进而引起突触传递和可塑性缺陷，表现为疾病的各种神经学症状。因此，恢复FRRS1L功能可能成为治疗该病的潜在策略。本研究旨在通过AAV介导的基因替代疗法，在Frrs1l基因敲除（KO）小鼠模型中评估其对分子、电生理、行为及生理表型的改善作用。该研究发表于《Neurotherapeutics》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用自互补型AAV9载体，携带由低表达JeT启动子驱动的密码子优化的人FRRS1L互补DNA（cDNA），构建AAV9-FRRS1L基因替代载体。对出生后10-14天（P10-P14）的Frrs1l KO小鼠（C57BL/6J背景，来源于EUCOMM和IMPC项目）进行鞘内（IT）注射，分为低剂量（5 × 10¹⁰ vg）和高剂量（3 × 10¹¹ vg）两组，对照组注射磷酸盐缓冲液（PBS）。通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测人FRRS1L mRNA表达；采用Western blotting（WB）分析膜富集组分和突触体组分中FRRS1L及AMPAR各亚基的蛋白水平；利用免疫荧光（IF）显微镜观察小脑和海马中FRRS1L及AMPAR的分布与信号密度；通过脑磁共振成像（MRI）测量脑体积和表面积；进行皮层电图（ECoG）记录以分析功率谱密度和发作性放电事件；开展一系列行为学测试（握力、转棒、水平梯子、旷场、条件性恐惧、埋珠实验）评估运动、认知和情感功能；并进行短期非良好实验室规范（non-GLP）安全性研究（血清生化、血液学和组织病理学）。

**研究结果**
**实验流程**：实验设计包括P7-9基因分型、P10-14鞘内注射、2-4个月与7-9个月两个时间点的分子和组织学检测，以及行为学和电生理评估，9个月时进行MRI和安全性研究。

**AAV9-FRRS1L治疗Frrs1l^-/-小鼠中FRRS1L mRNA和蛋白的持续恢复**：RT-qPCR显示，治疗后2-4个月和7-9个月全脑裂解液中人FRRS1L mRNA表达呈剂量依赖性且持续可检测，但低于内源小鼠FRRS1L水平；脊髓中表达等于或高于野生型（WT）。WB表明，高剂量组在小脑和脊髓的膜富集组分中FRRS1L蛋白水平接近WT，低剂量组部分恢复，但前脑-中脑区域未见显著改善。在小脑突触体组分中，高剂量组FRRS1L蛋白水平达WT的约50%，并维持至7-9个月。IF证实高剂量组小脑和海马中FRRS1L免疫信号显著恢复。

**AAV9-FRRS1L治疗Frrs1l^-/-小鼠中AMPAR水平的持续改善**：小脑突触体组分WB显示，高剂量组总AMPAR（PAN-AMPA抗体）及各亚基（GluA1、GluA2-3、GluA4）蛋白水平显著恢复，且持续至高龄。此外，RT-qPCR发现7-9个月未处理KO小鼠全脑GluA1和GluA2 mRNA水平显著降低，而治疗使其恢复至接近WT水平；GluA3和GluA4也有改善趋势。IF进一步显示，高剂量组小脑和海马（CA3区）中AMPAR信号密度显著增加。

**体重、脑容积和皮层电图（ECoG）改善**：体重监测显示高剂量组体重增长轨迹显著优于未治疗组。9个月时MRI容积测量发现未治疗KO小鼠脑体积和表面积显著减小，高剂量治疗后显著改善。ECoG记录表明，未治疗KO小鼠表现出慢波（δ/θ）功率占主导的异常节律和频繁的癫痫样放电（多棘波和棘波串），治疗后高剂量组功率谱分布趋于平衡，棘波串数量减少趋势接近统计学显著（p值分别为0.069、0.081、0.084）。

**神经和行为表型的挽救**：
- **握力**：高剂量组后肢握力在两个时间点均显著改善。
- **转棒**：高剂量组在两个时间点跌落潜伏期显著延长。
- **水平梯子**：高剂量组步进错误数和穿过时间显著减少，呈剂量依赖性。
- **旷场**：未治疗KO小鼠表现为过度活跃和中心区停留时间增多（认知异常），高剂量组活动水平部分下降，中心/周边时间分布显著趋向WT。
- **条件性恐惧**：高剂量组在情境和线索刺激下僵直时间显著增加，平均运动指数降低，显示联想记忆改善。
- **埋珠实验**：治疗组表现出剂量依赖性的埋珠数量增加趋势（未达统计显著）。

**短期非GLP安全性研究**：高剂量注射WT小鼠后约一个月，血清生化、血液学及组织病理学检查未见显著异常，支持治疗的可耐受性。

**讨论与结论**
研究讨论指出，通过多层面评估（分子、电生理、行为及生理），AAV9-FRRS1L基因替代在Frrs1l KO小鼠中实现了部分但一致性的表型改善，且多数结果呈剂量依赖性。治疗后小脑FRRS1L蛋白接近正常化，而脑外区域表达较低，但IF在海马中仍可检测到改善。突触AMPAR水平的恢复与FRRS1L表达相关，且高龄小鼠中AMPAR mRNA的升高提示可能逆转了神经退行性过程。尽管ECoG改善未达统计显著，推测可能因皮层转导不足，但行为学改善广泛，提示小脑功能在DEE37中可能起关键作用。安全性研究初步支持治疗耐受性。研究结论部分翻译如下：研究人员的这项研究是一个原理证明，即FRRS1L替代可以改变这种严重脑病（DEE37）的病程，从儿童期到更长时间。进入小脑尤为重要，因为它似乎对治疗效果有显著贡献；但可能需要更广泛的中枢神经系统分布。患者中实现完全治疗益处所需的优化解剖靶点和递送策略，以及中枢神经系统转导程度，仍有待进一步明确；特别是因为Frrs1l KO小鼠模型尽管捕捉了疾病的关键特征，但并未模拟确切的临床轨迹，尤其在退化和癫痫发作方面。最后，尽管在测试条件下未观察到毒性证据，但本研究未评估超生理水平FRRS1L（过度）表达的长期耐受性，因此需要进一步评估。使用改进的中枢神经系统递送方法（例如可通过转铁蛋白受体穿过血脑屏障的新型AAV衣壳）的未来研究，可通过血管系统及其毛细血管实现广泛均匀的全脑分布，以进一步评估FRRS1L基因替代治疗的转化潜力。