克里米亚-刚果出血热病毒RNA依赖的RNA聚合酶的结构

《Cell Discovery》：Structures of the Crimean-Congo hemorrhagic fever virus RNA-dependent RNA polymerase

　　

克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）被世界卫生组织（WHO）在其新兴流行病研发蓝图中指定为优先病原体，对全球健康构成重大威胁，但缺乏许可的疫苗或特异性抗病毒治疗。作为负责基因组复制和转录的唯一病毒酶，CCHFV L蛋白是一种大型多酶蛋白，但其异常大的尺寸（>450 kDa）和广泛的域结构阻碍了结构分析。在此，研究人员展示了全长CCHFV L蛋白在apo状态和与5′病毒RNA启动子结合的高分辨率冷冻电镜结构。这些结构揭示了布尼亚病毒目（Bunyavirales）中已知最大的聚合酶，并表明apo形式采用高度灵活的构象，其中多个功能元件保持无序。5′启动子RNA的结合触发广泛的构象重排，将这些元件组织成具有催化活性的活性位点。研究人员定义了一种保守的5′钩状结合模式，并识别出两个先前未被识别的残基（K1545和E1637），它们在NTP入口通道处形成收缩，代表了新定义的调节基序J和K，这些基序在Bunyavirales中保守。研究人员进一步表征了一个独特的、扩展的pendant结构域，该结构域对nairoviruses是特有的，虽然对启动子结合并非必需，但可能在RNA合成过程中调节内部通道内的模板移动。研究人员的成果提供了nairovirus聚合酶的第一个结构框架，阐明了CCHFV RNA合成的机制，并为针对这一高优先级病原体的结构引导抗病毒药物开发奠定了基础。

克里米亚-刚果出血热病毒（CCHFV）是一种由蜱传播的负链RNA病毒，属于布尼亚病毒目（Bunyavirales）中的内罗病毒科（Nairoviridae），可引起严重的出血热，病死率高达10%–40%。尽管该病毒在全球30多个国家流行，且被世界卫生组织（WHO）列为优先病原体，但目前仍缺乏许可的疫苗或特异性抗病毒药物。CCHFV的基因组由三个片段（S、M、L）组成，其中L片段编码一个大型多功能L蛋白，该蛋白包含RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）核心，负责病毒基因组的复制和转录。然而，CCHFV L蛋白的分子量超过450 kDa，远大于其他布尼亚病毒（通常240–260 kDa），且包含卵巢肿瘤（OTU）样蛋白酶结构域、内切核酸酶（EN）结构域以及多个插入结构域，其巨大的尺寸和复杂的域架构使结构解析长期受阻。为了阐明这一关键酶的分子机制，并为抗病毒药物设计提供结构基础，研究人员开展了本研究。

该研究于《Cell Discovery》发表，研究人员建立了全长CCHFV L蛋白（约450 kDa）在HEK293F细胞中的表达和纯化系统，通过冷冻电镜（cryo-EM）技术解析了其apo状态（未结合RNA）和与5′病毒RNA启动子复合物的高分辨率结构，分别达到2.85 ?和3.32 ?。这些结构首次揭示了内罗病毒聚合酶的组织架构，并发现了独特的pendant插入结构域以及两个保守的调节基序J和K，为理解CCHFV RNA合成机制和开发靶向抑制剂提供了基础。

### 关键技术方法
研究人员主要采用以下关键技术：1）使用HEK293F细胞表达全长及核心区域（残基926–3230）的CCHFV L蛋白，通过Strep-tag亲和层析和尺寸排阻色谱纯化至均一；2）单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）技术，利用Titan Krios显微镜（配备K3或Falcon4探测器）收集数据，经cryoSPARC软件处理，结合Topaz自动粒子挑选和三维分类，最终获得高分辨率密度图；3）生物层干涉测量法（BLI）定量分析L蛋白与5′病毒RNA的结合亲和力；4）体外放射性标记（［α-32P］-ATP）的RNA延伸实验检测聚合酶活性，以验证突变体的功能影响。

### 研究结果
#### Overall structure of the CCHFV L Core（CCHFV L蛋白核心的整体结构）
通过冷冻电镜解析apo结构，发现CCHFV L蛋白核心（残基925–3230）采用与流感病毒和其他布尼亚病毒聚合酶相似的三模块组织：PA样区域（残基587–1615）、PB1样区域（残基1616–2866，即RdRp核心）和PB2样区域（残基2867–3945）。PA样区域包含一个显著扩大的核心叶（core lobe）和vRNA结合叶（vRBL），其中vRBL含有保守的β-折叠和α-螺旋，负责识别病毒RNA。PB1样区域呈现典型的右手构象，包括手指、手掌和拇指亚结构域，手掌中含有高度保守的基序A–H，形成催化中心。PB2样区域包含桥（bridge）、拇指环（thumb ring）和盖子（lid）亚结构域，但约60%的残基因柔性未被解析。此外，在apo状态下，一个大的pendant插入结构域（残基1902–2230）仅能在低密度阈值下可见，表明其显著的无序性。N端的OTU蛋白酶和EN结构域以及C端的远端区域均未在密度图中出现，推测其固有构象柔性。

#### 5′ hook vRNA bound CCHFV L（5′钩状vRNA结合的CCHFV L蛋白）
研究人员通过BLI实验证实，全长CCHFV L蛋白与5′ vRNA?–??（18-mer）结合的解离常数Kd为7.12 nM，亲和力高。随后，解析了L蛋白核心（残基926–3230）与5′ vRNA复合物的3.32 ?冷冻电镜结构。该结构显示，5′ RNA的前10个核苷酸（U1–A10）形成特征性的钩状构象，位于由vRBL、核心叶、手指和手指节点形成的正电荷裂缝中，并由一个经典碱基对C2–G8稳定。与LASV和SFTSV相似，但不同于HTNV和LACV（后者有2–3个碱基对）。进一步突变实验表明，5′ RNA结合主要依赖其整体构象而非特异性碱基序列，单个碱基替换（如U3C、C4A）甚至能增强结合亲和力。此外，研究人员发现了一个独特的pendant插入结构域，由约15个α-螺旋组成，远大于沙粒病毒（如MACV和LASV）中的对应结构域（4–5个α-螺旋）。BLI分析显示，删除pendant结构域仅导致结合亲和力降低约2.5倍（Kd=17.6 nM），表明该结构域对启动子结合非必需。

#### Conformational rearrangements and activation upon 5′ vRNA binding（5′ vRNA结合诱导的构象重排与激活）
通过比较apo和5′ vRNA结合态的结构，发现5′ vRNA结合诱导聚合酶显著压缩，手指、手指节点和盖子等结构域向活性位点协同运动。同时，多个在apo状态中无序的区域（包括α-ribbon样插入、pendant结构域、手指远端、桥、引物环、指尖（motif F）和arch）在结合后变得有序，形成一个闭合的、具有催化活性的活性位点。特别地，研究人员识别出两个此前未知的残基K1545（位于核心叶）和E1637（位于手指），它们共同在NTP入口通道处形成收缩，被定义为新基序J和K。序列比对显示，这两个残基在Bunyavirales中严格保守。体外RNA合成实验表明，K1545A、E1637A及双突变体几乎完全丧失聚合酶活性，证实了J/K基序对NTP选择性和酶活性的关键作用。此外，pendant结构域缺失突变体（Δlarger pendant）也表现出严重的活性丧失，但该结构域不直接接触RNA，而是位于推测的模板进入/出口通道附近，提示其可能通过调节模板加载或释放来影响RNA合成。

### 总结与结论
讨论部分总结指出，CCHFV L蛋白的催化循环遵循布尼亚病毒聚合酶的保守模型：从apo状态的无序、非活性构象，经5′ vRNA启动子结合后稳定钩状构象并诱导有序化，促进3′模板招募和起始（可能通过prime-and-realign机制），随后进入延伸阶段。本研究捕捉到了该循环中最早期的基础状态，即apo和5′ vRNA结合态，揭示了nairovirus特有的扩展pendant结构域及其与模板通道的潜在耦合，为sNSV中之前未被识别的调节机制提供了证据。N端OTU结构域主要发挥免疫调节功能，EN结构域参与帽捕获，而C端区域可能参与转录相关调控，但仍有待进一步结构解析。研究结论翻译如下：总之，本研究所提出的结构框架因此为合理设计CCHFV特异性聚合酶抑制剂奠定了基础，并为针对世界上最致命的病毒病原体之一的抗病毒策略提供了宝贵指导。