RBM20变异破坏扩张型与非致密型心肌病干细胞模型中的Ca2+处理与代谢

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：RBM20 variants disrupt Ca2+ handling and metabolism in dilated and non-compaction cardiomyopathy stem cell models

　　

剪切调节因子RBM20的突变会导致射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)，通常表现为扩张型心肌病(DCM)。位于RS结构域634位的突变会导致伴有(R634L)或不伴有(R634W)左室非致密型心肌病(LVNC)的DCM。然而，表型变异性的潜在机制以及HFrEF之外的个性化治疗尚不清楚。研究人员从携带RBM20突变R634L(LVNC)或R634W(DCM)的患者中生成了诱导多能干细胞来源心肌细胞(iPSC-CM)、3D心肌球及工程化心肌组织。利用CRISPR/Cas9，研究人员创建了同源修复及突变插入系，鉴定出两者的RBM20错误定位、TTN与RYR2的剪接错误以及肌节不规则。DCM-CM显示静息Ca2+漏增加且Ca2+瞬变幅度减小（典型HFrEF特征），以及肌浆网与线粒体的空间紊乱。相反，LVNC-CM表现出由升高的cAMP和错剪接的高活性CAMK2D驱动的、具有更快动力学的Ca2+瞬变幅度升高，导致PLN超磷酸化及代谢呼吸增加。此外，LVNC显示可能源于Junction plakoglobin错剪接的桥粒紊乱及3D心肌球压实度降低。尽管机制不同，两者的收缩力均降低。同源对照证实了突变因果关系。维拉帕米药物干预部分改善了LVNC和DCM-CM中选定的异常Ca2+处理及收缩表型，而CAMK2D抑制剂AIP主要在LVNC-CM中改善了收缩期Ca2+处理。总之，同一RBM20残基上的不同氨基酸取代诱导了相反的Ca2+处理及结构表型。DCM表现为Ca2+处理受损，而LVNC表现为细胞间耦联缺陷及活化的Ca2+处理与代谢，但仍不足以补偿器官水平功能障碍。这支持了早期HF的个性化药物疗法及潜在的RBM20心肌病的CRISPR/Cas9修复。

该研究发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》。目前心脏衰竭尤其是射血分数降低的心力衰竭在临床中发病率高且预后差，其中扩张型心肌病贡献了百分之三十至四十的病例。左室非致密型心肌病则表现为心肌过度小梁化，其临床与遗传学与扩张型心肌病存在重叠，近期指南将其归类为扩张型心肌病的表型特征而非独立疾病。RNA结合基序蛋白20即RBM20的致病性变异约占临床确诊扩张型心肌病的百分之二至三，其突变热点位于高度保守的RS结构域第633至638位氨基酸，其中R634L变异特异性关联左室非致密型心肌病，而R634W关联单纯扩张型心肌病。然而同一基因甚至同一氨基酸位置的突变如何决定不同心肌病表型的机制尚不明晰，且针对RBM20心肌病的个性化治疗策略缺乏深入的机制支撑。为此，研究人员利用患者来源诱导多能干细胞及CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建了R634L与R634W两种变异的心脏细胞与组织模型，从分子、细胞到功能层面解析二者差异化的致病机制并探索潜在药物干预靶点。

为开展研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：招募携带RBM20 p.R634L的左室非致密型心肌病患者家族及携带p.R634W的扩张型心肌病患者家族获取体细胞并重编程为诱导多能干细胞；利用CRISPR/Cas9技术构建同源修复系及在同源背景下引入突变的插入系作为遗传对照；定向分化为诱导多能干细胞来源心肌细胞、培养3D心肌球及构建工程化人类心肌组织进行功能评估；应用单分子定位超分辨显微技术即dSTORM分析RBM20亚细胞定位；通过mRNA测序与定量PCR分析RBM20靶基因剪接异构体；采用透射电子显微镜观察超微结构；利用Fura-2-AM及Fluo-4-AM荧光探针检测胞质Ca²⁺瞬变与漏流；借助FRET探针检测cAMP动态；通过蛋白质免疫印迹分析PLN磷酸化状态；利用Seahorse能量测定仪检测线粒体耗氧率；并在细胞与组织水平进行维拉帕米、美托洛尔及AIP的药物干预实验。

研究结果如下：

患者特异性诱导多能干细胞来源心肌细胞来自具有不同RBM20突变的两种心肌病家系。研究人员从LVNC患者及DCM患者中获取样本重编程为iPSC并分化为高纯度心室样iPSC-CM，同时生成CRISPR/Cas9同源修复系作为对照。所有系均保持多能性及正常核型，分化效率高且成熟标记表达正确，为研究提供了可靠模型。

RBM20突变影响蛋白定位及RBM20依赖的剪接靶标。Western blot显示突变不影响RBM20总蛋白量，但dSTORM超分辨成像表明LVNC与DCM心肌细胞中RBM20在胞质异常积累且核质比显著降低，其中DCM突变R634W的细胞质积累更显著。转录组分析显示整体基因表达差异并非主要驱动因素，而RBM20靶基因剪接异构体存在显著差异，两者共享TTN与RYR2的错剪接，但在CAMK2D、TRDN、LDB3等基因上呈现突变特异性的剪接模式，3D培养增强了剪接表型的检出。

LVNC与DCM心肌细胞的超微结构与肌节损伤由不同RBM20突变引起。透射电镜显示LVNC心肌球中桥粒长度缩短、间距增大，而DCM心肌球中肌浆网与线粒体距离增加。测序发现LVNC在桥粒相关基因JUP上存在更多差异外显子使用事件。肌节染色与傅里叶分析表明两种突变均导致Z盘与M线规律性显著下降，同源修复后恢复，提示TTN错剪接与RBM20错位共同导致肌节紊乱。

LVNC与DCM心肌细胞存在功能失调的Ca²⁺稳态与收缩性。LVNC-CM的Ca²⁺瞬变上升与松弛时间加速、幅值升高且对异丙肾上腺素响应钝化；DCM-CM则表现为Ca²⁺漏显著增加、瞬变幅值降低。工程化心肌组织显示两者主动收缩力均下降，主动与被动力比值降低，LVNC收缩与松弛时间更快，与其细胞水平Ca²⁺动力学一致。

LVNC心肌细胞特异性表现cAMP水平升高及PLN磷酸化增强而非DCM心肌细胞。FRET检测显示LVNC-CM基础cAMP水平显著升高。Western blot表明LVNC中PKA介导的PLN-S16p与CAMK2D介导的PLN-T17p基础磷酸化均增强，异丙肾上腺素刺激后增量减弱，反映基础态已处于高激活状态，而DCM无明显改变。

LVNC心肌细胞而非DCM心肌细胞表现线粒体呼吸增强。LVNC-CM线粒体网络更发达、线粒体Ca²⁺水平及膜电位升高，基础与最大耗氧率均增加，显示代谢激活；DCM则无此现象，且其肌浆网与线粒体距离增加可能影响线粒体Ca²⁺摄取与能量耦合。

RBM20为基础心肌病的药物干预。维拉帕米降低LVNC-CM的Ca²⁺瞬变速率并恢复β肾上腺能响应，提升LVNC工程化心肌收缩力，同时减少DCM-CM的Ca²⁺漏；美托洛尔仅恢复异丙肾上腺素响应。CAMK2D抑制剂AIP显著降低LVNC-CM的Ca²⁺瞬变幅值并降低最大耗氧率，而对DCM影响较小。提示维拉帕米与AIP在不同层面改善突变特异的表型。

LVNC背景中的DCM突变p.R634W镜像DCM表型。在resLVNC系中引入R634W生成的resLVNC-DCM.W-CM在TTN与RYR2剪接、膜电位、肌节规律性、工程化心肌收缩力及松弛时间上均与DCM1相似而非LVNC，证明突变本身而非遗传背景决定表型走向。

讨论部分总结指出，传统HFrEF以Ca²⁺瞬变幅值降低与回摄减慢为核心，而研究发现同一位点RBM20变异可导致截然相反的细胞表型：R634W-DCM表现为经典低幅值、高漏流与肌浆网线粒体解偶联；R634L-LVNC则呈高cAMP、高磷酸化、高Ca²⁺幅值与高代谢的预激活状态，伴随桥粒紊乱所致组织非致密化。分子上两者共有RBM20胞质错定位与TTN、RYR2错剪接，但LVNC特异性伴随CAMK2D与桥粒基因错剪接驱动高活化表型。药物上维拉帕米对两者均部分有益，AIP主要改善LVNC，为早期个性化治疗提供依据。同源修复逆转多数表型支持CRISPR/Cas9基因编辑的潜力。研究也存在iPSC-CM成熟度限制及样本性别数量有限的不足。结论部分表明RBM20变异常被视作单一实体，但本报告显示突变至关重要并导致不同病理，在精准医学推进中需予以考量。