超临界CO2萃取选择性回收光果甘草叶中黄烷酮富集组分及其神经保护潜力

《Antioxidants》：Selective Recovery of Flavanone-Enriched Fractions from Glycyrrhiza Glabra Leaves by Supercritical CO2 Extraction with Neuroprotective Potential

　　

光果甘草(Glycyrrhiza glabra)叶(GGL)是甘草供应链中未充分利用的副产物，也是生物活性黄烷酮的重要来源。本研究优化了超临界CO2流体萃取(SFE-CO2)工艺，用于选择性回收叶表渗出物中的黄烷酮（乔松素、甘草黄酮酮和光甘草宁）。结合响应面法(RSM)与超高效液相色谱-紫外检测(UHPLC–UV)分析确定了最优条件，获得了高纯度（31%黄烷酮）、无溶剂且即用型的富集提取物。SFE-CO2在选择性和富集能力方面优于基于溶剂的液体萃取。Path2Green评估表明该工艺具有环境可持续性和可规模化特征。该提取物在帕金森病(PD)酵母模型中表现出抗氧化和抗衰老效应，延长了寿命并降低了氧化应激。含量最丰富的黄烷酮乔松素在体外抑制α-突触核蛋白聚集，并在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)模型中改善PD相关表型，提升运动性能并增加细胞能量代谢。这些结果支持了将GGL可持续增值转化为具有衰老相关疾病营养保健应用潜力的黄烷酮富集提取物。

研究背景方面，光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)的传统利用集中于根与根茎，而其旺盛的地上部生物质即光果甘草叶(GGL)作为农业副产物常在根收获时被废弃，造成资源浪费。GGL富含乔松素(pinocembrin)、异戊烯基黄烷酮及二氢芪类等亲水性较低的叶表渗出物代谢物，具备抗菌、抗炎、抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制及抗衰老等生物活性，且在酵母模型中已显示出降低活性氧(ROS)、缓解α-突触核蛋白毒性和细胞衰老的潜力。然而常规溶剂萃取存在有机溶剂消耗大、选择性差、共萃基质成分多及后续纯化成本高等问题。为实现农业废弃物高值化与绿色提取，研究人员开展本研究，采用超临界CO₂流体萃取(SFE-CO₂)这一绿色、无毒、可回收且适用于疏水性化合物回收的技术，对GGL中叶表黄烷酮进行选择性富集，并评估其神经保护潜力，以支撑PD及相关衰老疾病的营养保健应用。该研究发表于《Antioxidants》。

关键技术方法包括：样本为意大利卡拉布里亚PDO产区花期3–4年生光果甘草var. typica叶片，50℃烘干至含水6–9%后粉碎过筛300–600 μm并真空保存；采用Spe-ed Helix超临界流体萃取仪进行SFE-CO₂，以响应面法(RSM)基于Box–Behnken设计优化温度、压力与动态时间三因素，并以超声辅助 exhaustive 提取（70%乙醇）与浸渍法（氯仿、正己烷）作对照；提取物组成用Ultimate 3000 UHPLC系统配Kinetex C18柱与RS可变波长检测器于290 nm定量乔松素、甘草黄酮酮(licoflavanone)、光甘草宁(glabranin)；抗氧化能力用ABTS自由基清除与氧自由基吸收能力(ORAC)测定；生物活性分别在人α-突触核蛋白过表达的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) BY4742模型评估寿命与ROS，Thioflavin T(ThT)荧光法测α-突触核蛋白纤维伸长，黑腹果蝇DJ-1β^ex54突变体PD模型评估攀爬能力、寿命、蛋白羰基化、ATP与糖原水平。

研究结果如下：

3.1. Selective Recovery of GGL Flavanones by SFE-CO₂

初步实验在300 bar下升温40–80℃可提高总黄烷酮(Fs)回收约47%，确认80℃为上界；压力150–450 bar中高压提升萃取效率但过高损及选择性，故设上限400 bar；动力学显示前30 min为恒速期，其后受扩散控制。RSM优化表明压力(B)及其二次项(BB)影响最显著，温度(A)主要影响纯度相关变量且40℃最优，动态时间(C)延长提高萃取效率(EE)与萃取产率(EY)但降低选择性。以纯度与回收兼顾的多响应优化得40℃、370 bar、90 min（期望指数0.92）；引入CO₂消耗量后再优化得40℃、364 bar、30 min（期望0.94），黄烷酮纯度约31%，CO₂消耗降至三分之一。与溶剂萃取比，SFE-CO₂提取物Fs含量约为氯仿的3倍、正己烷的16倍，氯仿浸渍产率高但共萃蜡质脂质致纯度低，正己烷最差；SFE-CO₂抗氧化能力(ABTS与ORAC)较氯仿与exhaustive提取高27–42%。Path2Green评价实验室规模得分+0.201，优势在可再生废弃生物质、安全可回收CO₂、低预处理影响、免纯化即用品、应用潜力与可放大性，限制在于运输、产率、能耗与废物；放大规模可通过现场装机与残基质再利用改善。

3.2. Neuroprotective Properties of SFE-CO₂Extract and Pinocembrin

在酵母PD模型中，0.2% SFE-CO₂提取物延长了平均与最大寿命并降低24 h细胞内ROS；150 μM乔松素同样显著延长寿命约1.5倍（平均）与1.6倍（最大），ROS降低约16%。ThT聚集动力学显示在预成种纤维存在下，10 μM与100 μM乔松素分别抑制α-突触核蛋白纤维伸长约30%与50%，呈剂量依赖。

在黑腹果蝇DJ-1β突变体PD模型中，发育期饲喂100 μM与200 μM乔松素，200 μM显著改善5日龄雌蝇负趋地攀爬能力；蛋白羰基化在两组浓度均显著降低，与酵母ROS下降一致。仅成虫期200 μM处理同样在羽化后5日与15日提升运动性能，但200 μM未显著延长寿命，提示乔松素改善健康跨度而非寿命。代谢指标显示100 μM与200 μM乔松素剂量依赖性提升ATP水平，200 μM显著增加糖原储备，表明其调节细胞能量代谢与储能。

讨论与结论部分总结：研究人员指出SFE-CO₂是光果甘草未利用生物质增值的有效可持续策略，符合循环经济与资源管理。优化工艺选择性回收叶表乔松素、甘草黄酮酮与光甘草宁，获得高纯度无溶剂提取物，Path2Green证实环境影响应低于常规溶剂法，具工业放大潜力并可增强PDO卡拉布里亚甘草价值链，但需进一步技术经济分析。SFE-CO₂提取物在ABTS与ORAC中抗氧化增强，在酿酒酵母PD模型降低氧化应激与α-突触核蛋白毒性；乔松素作为主要成分具抗氧化与抗聚集性，在黑腹果蝇PD模型改善运动、降低氧化蛋白损伤并提升ATP与糖原，支持其维持细胞能量稳态的作用。这些发现为选择性黄烷酮萃取工艺开发及天然黄烷酮类化合物作为药物与营养保健基料提供参考，凸显SFE-CO₂在功能食品与神经保护营养品规模化生产及农业副产物可持续增值中的潜力。

结论原文翻译：本研究表明，SFE-CO₂是光果甘草未充分利用生物质增值的有效且可持续的策略，与可持续资源管理及循环生物经济一致。优化的SFE-CO₂实现了叶表黄烷酮乔松素、甘草黄酮酮与光甘草宁的选择性回收与富集，获得高纯度、无溶剂且较常规溶剂法环境影响更低的提取物，Path2Green评估证实了这一点。该方法支持工业规模化，并可增强PDO卡拉布里亚甘草的价值链，尽管仍需专门的技术经济研究来明确其工业可行性。重要的是，SFE-CO₂提取物在互补的ABTS与ORAC分析中显示出增强的抗氧化能力，并保留了先前与GGL相关的抗氧化活性，在酿酒酵母(S. cerevisiae) PD模型中降低氧化应激与α-突触核蛋白诱导的毒性。在主要成分中，乔松素作为一种关键生物活性化合物显现出来，表现出抗氧化与抗聚集特性。此外，在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) PD模型中，乔松素改善了运动性能、减少了氧化蛋白损伤并增强了ATP产生与糖原储存，支持其在维持细胞能量稳态中的作用。除生物学相关性外，这些发现为选择性黄烷酮萃取工艺开发提供了有益参考，尤其考虑到对天然黄酮类与黄烷酮基类生物活性模板在药物与营养保健应用的日益关注。总体而言，这些结果凸显了SFE-CO₂作为一种绿色技术，在具有功能食品与神经保护营养保健品应用的生物活性富集提取物规模化生产，以及促进农业副产物可持续增值方面的潜力。

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