综述：急性缺血性脑卒中中铁死亡相关分子事件的传感与光学成像：机制、技术与转化展望

《Chemosensors》：Sensing and Optical Imaging of Ferroptosis-Related Molecular Events in Acute Ischemic Stroke: Mechanisms, Technologies and Translational Perspectives

　　

急性缺血性脑卒中（AIS）后的再灌注触发了一系列铁死亡相关的分子事件，包括铁稳态失衡、氧化/硝化应激、抗氧化剂耗竭和膜脂质过氧化。传统的铁死亡检测主要依赖于离体或终点测量，限制了其动态监测缺血-再灌注期间这些事件时空演变的能力。化学传感和光学成像的最新进展使得能够原位检测关键的铁死亡相关节点，如Fe²⁺/不稳定铁池（LIP）、活性氧（ROS）/过氧亚硝酸根（ONOO^?）、谷胱甘肽（GSH）/半胱氨酸（Cys）/谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、硫化氢（H₂S）/Cys-甲硫氨酸（Met）代谢以及脂质过氧化。在这篇综述中，研究人员总结了AIS相关铁死亡的传感靶点、基于反应的探针设计、近红外（NIR）和双光子成像、光声成像（PAI）以及多模态验证策略。讨论了针对H₂O₂、ONOO^?、H₂S、Fe²⁺和脂质过氧化的代表性探针在细胞模型、氧糖剥夺/再复氧（OGD/R）、大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）以及体内脑成像中的应用。研究人员强调，单个探针信号不能独立确认铁死亡，应与GPX4/酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）的改变、丙二醛（MDA）/4-羟基壬烯醛（4-HNE）水平、组织损伤、神经功能结局以及铁抑素-1（Fer-1）/脂氧抑素-1（Lip-1）拯救实验一起解释。最后，研究人员讨论了当前的挑战，包括有限的组织穿透、血脑屏障递送、定量稳定性、探针安全性和临床转化，并强调了涉及比率型、NIR/NIR-II、双光子、多靶点和成像引导验证策略的未来方向。

1. Introduction
急性缺血性脑卒中（AIS）再灌注治疗常引发缺血-再灌注损伤，其中铁死亡（ferroptosis）是关键机制。传统检测方法多为离体或终点分析，难以动态监测分子事件的时空演变。化学传感和光学成像技术可原位检测铁死亡相关分子节点，如Fe²⁺/不稳定铁池（LIP）、活性氧（ROS）/过氧亚硝酸根（ONOO^?）、谷胱甘肽（GSH）/半胱氨酸（Cys）/谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、硫化氢（H₂S）/Cys-甲硫氨酸（Met）代谢及脂质过氧化。本综述从传感与成像视角出发，建立可检测分子事件与传感策略、成像技术、验证方法和转化考量之间的实用框架。

2. Sensor-Accessible Ferroptosis-Related Molecular Events in AIS
铁死亡是由铁稳态失衡、氧化/硝化应激增强、抗氧化防御受损和膜脂质过氧化失控驱动的连续分子过程。各分子节点提供不同病理信息：Fe²⁺/LIP反映上游铁稳态紊乱；ROS/ONOO^?反映再灌注相关氧化/硝化应激；GSH/Cys改变指示抗氧化底物可用性和细胞内氧化还原状态；GPX4功能障碍代表脂质氢过氧化物解毒能力受损；脂质ROS、含多不饱和脂肪酸的磷脂氢过氧化物（PUFA-PL-OOH）、丙二醛（MDA）和4-羟基壬烯醛（4-HNE）与铁死亡执行阶段更相关。因此，铁死亡传感应明确信号对应的级联步骤、适用模型和证据边界，并与GPX4/酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）改变、MDA/4-HNE水平及铁死亡抑制剂拯救实验联合解释。

2.1. Labile Iron Pool: Early Monitoring Value of Fe²⁺/LIP
铁代谢紊乱是铁死亡启动的基础事件。AIS再灌注期间，线粒体损伤、溶酶体功能异常、铁蛋白降解和血红素代谢异常可促进活性铁释放。Fe²⁺/LIP可作为早期上游分子事件指示剂。荧光和近红外（NIR）探针可实现活体Fe²⁺动态可视化。传感策略包括配位型荧光响应、Fe²⁺依赖氧化还原反应或N-氧化物脱氧过程。Fe²⁺信号增加应结合脂质过氧化、GPX4/ACSL4改变及铁死亡抑制剂（如ferrostatin-1或liproxstatin-1）逆转实验进行解释。

2.2. Oxidative and Nitrative Stress: Reperfusion-Responsive ROS/ONOO^?
再灌注后线粒体功能障碍、NADPH氧化酶活化和炎症细胞募集导致ROS快速积累。过氧亚硝酸根（ONOO^?）参与线粒体损伤、血脑屏障（BBB）功能障碍和神经炎症。ROS/ONOO^?是早期氧化/硝化应激的重要成像靶点。NIR荧光探针已用于小鼠脑缺血再灌注模型中ONOO^?实时监测。H₂O₂通常通过芳基硼酸酯氧化和脱保护检测，ONOO^?通过氧化、硝化或肼裂解触发NIR信号变化。这些信号应结合脂质过氧化、GPX4改变和铁死亡抑制剂拯救实验进行解读。

2.3. Antioxidant Defense: Functional Status of the GSH/Cys/GPX4 Axis
GSH/GPX4轴是核心抗氧化防御系统。GPX4依赖GSH将膜磷脂氢过氧化物还原为脂醇，阻断脂质过氧化链反应。半胱氨酸（Cys）是GSH合成的关键底物。System Xc^?（SLC7A11）-Cys-GSH-GPX4轴构成铁死亡抗氧化防御核心。监测GSH和Cys可反映抗氧化储备状态。多种传感策略利用硫醇亲核性，如迈克尔加成、亲核取代、二硫键还原和环化反应。GPX4更常作为机制标记物。GSH/Cys降低应结合GPX4表达/活性、脂质过氧化、铁稳态及铁死亡抑制剂反应进行评估。

2.4. Membrane Lipid Peroxidation: A Key Readout of Ferroptotic Execution
膜脂质过氧化是最直接的铁死亡损伤指标。ACSL4促进多不饱和脂肪酸（PUFA）掺入膜磷脂，增加氧化敏感性底物。再灌注后Fe²⁺升高、ROS过量、GPX4解毒功能受损共同促进PUFA磷脂转化为脂质氢过氧化物，进而生成MDA和4-HNE。成像中，C11-BODIPY 581/591和Liperfluo通过荧光变化报告脂质氧化，适用于细胞和离体组织水平。脂质ROS较Fe²⁺、ROS或GSH单独变化提供更强的铁死亡证据，但仍需结合ACSL4、GPX4、MDA/4-HNE和铁死亡抑制剂逆转实验。

2.5. Metabolic Susceptibility: Sensing Significance of the Cysteine–Methionine Axis
Cys-Met代谢网络通过调节Cys供应、GSH合成、H₂S生成和GPX4功能影响铁死亡易感性。细胞Cys稳态由System Xc^?介导的胞外胱氨酸摄取和甲硫氨酸依赖的转硫途径（CBS/CGL）共同维持。多节点传感（Cys、GSH、H₂S、SLC7A11、CBS/CGL、GPX4）有助于确定抗氧化防御受损的起源。H₂S响应NIR探针HL-H₂S已用于体内卒中相关铁死亡评估。

3. Chemical Sensing Strategies for Ferroptosis-Related Molecules: From Molecular Recognition to Signal Conversion
化学传感通过偶联特异性识别基团与可检测光学输出，将Fe²⁺、ROS/ONOO^?、GSH/Cys、H₂S和脂质过氧化产物转化为荧光、NIR、比率型或光声（PAI）信号。探针性能取决于识别基团、信号转换机制和理化性质。对于AIS转化应用，还需评估探针信号与铁死亡指标和病理结果的相关性。

3.1. Reaction-Based Probes: Signal Conversion Driven by Redox and Thiol Reactions
基于反应的探针利用氧化还原或硫醇反应驱动荧光增强、光谱位移、比率响应或NIR吸收变化。芳基硼酸酯用于H₂O₂传感，可设计为比率型双光子探针用于卒中铁死亡成像。ONOO^?探针利用肼、烯烃、硫醚或芳香胺基团，已用于脑缺血再灌注小鼠模型实时监测。GSH/Cys探针利用硫醇亲核性，区分Cys和GSH的关键在于分子大小和环化倾向。脂质过氧化探针如C11-BODIPY和Liperfluo适用于细胞和组织水平铁死亡执行阶段验证。但不可逆反应、选择性不足和定量困难限制了其应用。

3.2. Capturing Active Iron: Applicable Scenarios for Fe²⁺ Probes
Fe²⁺探针分为配位型和反应型。RhoNox-1利用N-氧化物化学选择性响应Fe²⁺，FerroOrange和FerroFarRed扩展了成像颜色范围，适用于活细胞不稳定铁池成像。但这些探针在AIS体内脑成像中直接证据有限，目前主要用于细胞和组织水平。

3.3. Metabolite-Responsive Probes: Dynamic Observation of the Cys-GSH-H₂S Axis
Cys/GSH探针利用丙烯酸酯、醛基、氰基等亲电基团与Cys反应，或通过二硫键还原检测GSH。H₂S探针常用叠氮还原、硝基还原、亲核加成等机制。HL-H₂S探针采用“H₂S触发-羰基硫释放-H₂S再生”设计，具有NIR发射和粘度响应特性，已在erastin/RSL3诱导细胞铁死亡、OGD/R模型和小鼠MCAO/R模型中验证，结合Fe²⁺、MDA、GSH、GPX4、TTC染色和神经功能评分。SAM/SAH传感是更上游的未来方向。

3.4. Subcellular Localization Sensing: Mitochondria, Lysosomes, and Membrane Lipid Microenvironments
通过靶向基团（三苯基膦阳离子线粒体靶向、吗啉基团溶酶体靶向、长烷基链膜锚定）实现亚细胞定位传感。C11-BODIPY和Liperfluo用于膜脂质氧化检测。基因编码传感器如Grx1-roGFP2和HyPer可实现长期动态监测，但依赖转染或转基因模型，体内应用有限。

3.5. Multitarget Sensing Platforms: Improving Combinatorial Identification of Ferroptosis
双响应、比率型、级联响应探针和纳米平台可同时监测多个节点。纳米平台可改善BBB穿透和缺血区域富集，但粒径控制、代谢清除和长期毒性限制转化。不同探针发展水平不一：H₂O₂和ONOO^?探针已用于动物模型；HL-H₂S证据相对完整；C11-BODIPY和Liperfluo用于脂质过氧化验证；Fe²⁺探针在活细胞中成熟，体内证据不足。多模态成像强调荧光、NIR/NIR-II、双光子和PAI互补。

4. Optical Imaging Strategies for Ferroptosis-Related Molecules in AIS
光学成像关注信号在细胞、组织和活脑中的分布和动态变化，需结合成像深度、空间分辨率、模型适用性和验证目的。

4.1. Fluorescence Imaging: Mechanistic Validation in Cells, Brain Slices, and Tissue Sections
荧光成像适用于OGD/R细胞模型、离体脑片和组织切片，可确认信号激活、细胞类型分布和亚细胞定位。Fe²⁺、ROS、GSH和脂质过氧化信号需结合GPX4、ACSL4、MDA/4-HNE和铁死亡抑制剂拯救实验解释。亚细胞定位成像有助于揭示线粒体、溶酶体、内质网和细胞膜之间的信号序列。但穿透深度浅、散射和自发荧光限制体内应用。

4.2. NIR and Two-Photon Imaging: In Vivo and Semi-In Vivo Brain Tissue Observation
NIR和双光子成像可降低组织自发荧光和散射，提高穿透深度。适用于小动物活体成像、颅窗观察和离体脑片。NIR探针可观察缺血核心、半暗带和再灌注区域的氧化/硝化应激、抗氧化防御和代谢状态。但信号受BBB通透性变化影响，需结合离体验证和铁死亡标志物检测。

4.3. Photoacoustic Imaging: Evaluation of Oxygenation, Hemoglobin, and Microcirculatory Background
PAI利用光学吸收和超声穿透，可监测氧合血红蛋白、脱氧血红蛋白、氧饱和度和微血管灌注。在AIS铁死亡研究中，PAI主要提供血流动力学和微循环背景，而非直接检测铁死亡分子。分子响应PAI探针仍处于概念验证阶段。

4.4. Functional Validation of Imaging Results: From Molecular Signals to Tissue Injury and Neurological Function
成像结果需多层验证：与GPX4/ACSL4/MDA/4-HNE等铁死亡标志物交叉验证；与TTC染色、NeuN染色、Fluoro-Jade B染色等组织损伤指标相关；与神经行为学评分关联；并通过Fer-1/Lip-1药理学拯救确认铁死亡相关性。只有建立“分子成像-组织损伤-功能结局-药理学干预”的闭环验证，信号才具有机制解释性和治疗评估价值。

5. Integrated Applications of AIS Ferroptosis Sensing and Imaging: From Mechanistic Validation to Therapeutic Evaluation
集成应用需将探针信号与区域脑灌注、铁死亡标志物、组织损伤、药理学拯救和神经功能结局统一评估。

5.1. Multiscale Integration: From Molecular Events to Regional Brain Injury
AIS缺血-再灌注存在显著空间异质性。缺血核心可能已不可逆损伤，半暗带分子信号（如Fe²⁺升高、GSH耗竭、脂质过氧化积累）可能提示向铁死亡执行阶段转变，再灌注区域信号需结合BBB通透性、灌注和氧合状态解释。多尺度整合应强调分子探针信号与解剖区域、灌注状态和最终梗死边界的空间配准。

5.2. Metabolic Axis-Oriented Dynamic Monitoring: CBS-Cys-GSH-GPX4
CBS-Cys-GSH-GPX4轴强调细胞为何进入铁死亡易感状态。CBS和CGL参与转硫途径提供内源性Cys。传感设计分三个层次：底物水平（Cys/GSH探针）、通路水平（SLC7A11、CBS/CGL、H₂S、SAM/SAH）和功能水平（GPX4活性、脂质过氧化成像、Fer-1拯救）。动态监测该轴可反映代谢重编程和抗氧化防御能力变化。

5.3. Imaging-Guided Intervention Validation: CA, AOAA, and Fer-1/Lip-1 as Functional Controls
CA作为Nrf2/GSH/GPX4抗氧化保护通路干预工具，可减轻AIS铁死亡损伤，但现有研究以生化指标为主，尚未建立完整成像验证链。AOAA用于CBS/H₂S/Cys代谢轴机制验证，但选择性有限。Fer-1/Lip-1是铁死亡特异性阳性对照，HL-H₂S探针研究已将其纳入验证体系。三者对应不同验证逻辑：抗氧化保护、代谢轴调控和铁死亡特异性确认。

6. Clinical Translational Challenges and Future Directions
6.1. Challenges for Clinical Translation
主要挑战包括：BBB递送异质性、深部脑结构成像困难、缺乏定量标准、机制特异性和疾病异质性。大多数传感策略仍限于细胞、脑片或小动物模型，无创定量评估人类大脑铁死亡的方法尚缺。

6.2. Future Directions: Multimodal Validation and Precise Evaluation of AIS Ferroptosis Molecular Events
未来方向包括：时间分辨成像捕捉不同阶段分子事件；多模态整合构建分子事件-区域脑损伤-功能结局证据链；人工智能和影像组学定量整合；个性化评估识别不同损伤亚型；诊疗一体化平台作为长期方向。关键问题：探针信号能否稳定反映分子事件？是否对应血流、组织损伤和功能结局？能否被铁死亡抑制剂逆转？

7. Conclusions
铁死亡是AIS再灌注损伤的重要机制。多节点、动态、可验证的分子监测优于单指标判断。不同探针和成像模态应根据传感靶点、模型适用性和信号解释边界合理定位。未来需在探针递送、定量成像、生物学验证和多模态集成方面取得进展，以建立分子传感-成像背景-药理学验证-功能结局一致证据链。