《Bioactive Materials》：Chitosan-based nerve guidance conduits functionalized with fibroblast-derived extracellular vesicles promote peripheral nerve regeneration via miR-143-3p delivery
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成纤维细胞是周围神经的核心细胞成分之一，在周围神经再生过程中发挥着关键作用；然而，来源于周围神经成纤维细胞的细胞外囊泡是否能够促进神经再生仍不清楚。在此项研究中，研究人员首次证明了来源于周围神经成纤维细胞的细胞外囊泡在体外能够显著促进运动和感觉神经元的生长与再
成纤维细胞是周围神经的核心细胞成分之一，在周围神经再生过程中发挥着关键作用；然而，来源于周围神经成纤维细胞的细胞外囊泡是否能够促进神经再生仍不清楚。在此项研究中，研究人员首次证明了来源于周围神经成纤维细胞的细胞外囊泡在体外能够显著促进运动和感觉神经元的生长与再生。为了评估成纤维细胞-EVs在神经移植中的应用潜力，研究人员构建了一种负载成纤维细胞-EVs的壳聚糖神经导向导管，并将其用于桥接大鼠12毫米长的坐骨神经缺损。一系列功能和形态学评估表明，负载EVs的NGCs显著加速了感觉、运动和电生理功能的恢复，刺激了再生轴突的生长和髓鞘再生，并减轻了失神经支配引起的靶肌肉萎缩。为了阐明潜在的分子机制，研究人员通过miRNA测序筛选了成纤维细胞-EVs中富集的miRNAs。在这些miRNAs中，丰度最高的miR-143-3p被确定为轴突再生的潜在调节因子。进一步的研究表明，miR-143-3p通过靶向轴突生长的负调节因子Limk1来促进神经再生。本研究扩展了对成纤维细胞在周围神经再生中作用的理解，并表明研究人员开发的基于生物活性材料的NGCs可能为周围神经修复的组织工程神经移植物提供一种有前景的设计。
周围神经损伤是一种常见且致残的疾病，常导致患者受累肢体出现运动和感觉缺陷，严重影响其生活质量。在无法实现神经断端无张力对合的周围神经缺损病例中，手术治疗是最佳选择，自体神经移植通常被认为是金标准。然而，自体神经移植的固有局限性促使研究人员致力于开发组织工程神经移植物作为替代或补充方案。随着对机制理解的深入，组织工程神经移植物的设计逐渐转向利用生物线索对基于生物材料的神经导向导管进行功能化。在各种生物线索中，细胞外囊泡作为无细胞疗法的关键候选者引起了广泛关注。EVs是由细胞分泌的脂质双分子层纳米囊泡，富含多种生物活性分子，能够介导细胞间通讯并调节组织微环境。
在周围神经组织中，成纤维细胞与轴突和许旺细胞共同构成了主要的细胞类型。长期以来，许旺细胞在周围神经再生中的作用已得到充分认可，而成纤维细胞则常被认为通过参与瘢痕形成而阻碍神经再生。然而，近年来研究发现，周围神经损伤后，成纤维细胞会率先迁移至损伤部位并引导许旺细胞和轴突的生长。成纤维细胞主要通过其分泌物（包括分泌蛋白和EVs）发挥功能。尽管前期研究已经证实成纤维细胞通过分泌蛋白调节神经再生，但成纤维细胞衍生的EVs在周围神经再生中是否发挥类似作用仍不清楚。因此，本研究旨在探索利用外周神经成纤维细胞来源的EVs作为特定生物线索，工程化构建一种新型功能化神经移植物。该研究近期发表于《Bioactive Materials》。
在本研究中，研究人员使用了从南通大学实验动物中心获取的Sprague-Dawley (SD)大鼠作为动物模型。为开展研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：采用差速消化和差速贴壁法分离纯化外周神经成纤维细胞，并利用试剂盒提取其分泌的EVs；通过微流控装置结合轴突横切模型在体外评估了EVs对运动和感觉神经元突起生长及轴突再生的影响；构建了负载纤维母细胞-EVs的壳聚糖基NGC以桥接大鼠坐骨神经缺损模型，结合步态分析、电生理检测和透射电子显微镜（TEM）等形态学方法系统评价了神经修复效果；利用miRNA测序、双荧光素酶报告基因实验和qPCR探讨了EVs促进神经再生的分子机制。
纤维母细胞、神经元及EVs的鉴定与体外功能评估
研究人员从大鼠坐骨神经中分离出成纤维细胞并进行了鉴定。实验表明，成纤维细胞-EVs能够被运动神经元有效内化。在体外实验中，成纤维细胞-EVs以浓度依赖的方式促进了运动神经元的突起生长，在4×10
8 particles/mL时达到峰值。通过微流控装置证实，该最佳浓度的EVs不仅显著促进了运动和感觉神经元的突起生长，还在轴突横切后显著增强了两种神经元的轴突再生能力。
负载成纤维细胞-EVs的NGC修复大鼠坐骨神经缺损
研究人员构建了负载成纤维细胞-EVs的壳聚糖基NGC，并利用Matrigel作为缓释载体。体外释放实验显示，EVs在模拟体液（SBF）中能够持续释放长达28天。体内实验显示，术后1至4天，NGC释放的EVs逐渐被神经组织摄取。扫描电子显微镜（SEM）观察表明，术后2至4周NGC结构保持完整且无肿胀，再生神经组织在第4周时已占据整个导管腔并呈现出有序的束状排列。
神经移植后的功能恢复评估
通过足底热痛觉测试和CatWalk步态分析，研究人员评估了术后大鼠的感觉和运动功能恢复情况。结果显示，负载EVs的NGC组的感觉和运动功能恢复显著优于普通NGC组，某些指标甚至接近或超过自体神经移植组。电生理检测表明，EVs-loaded NGC组的复合肌肉动作电位（CMAP）振幅和运动神经传导速度（MCV）显著高于普通NGC组，且CMAP潜伏期明显缩短。此外，氟金（FG）逆行追踪结果显示，EVs-loaded NGC组背根神经节（DRG）中感觉神经元的阳性数量显著多于普通NGC组，表明该设计有效促进了感觉轴突的再生。
神经移植后的神经再生与靶肌肉萎缩评估
术后12周的免疫组化分析显示，EVs-loaded NGC组较普通NGC组具有更均匀的S100β染色和更密集的NF200阳性轴突。TEM检查表明，EVs-loaded NGC组的有髓轴突直径更大，髓鞘板层数更多，且G-ratio显著降低，表明其促进了再生轴突的髓鞘再生。在靶肌肉方面，EVs-loaded NGC组靶肌肉的湿重比和肌纤维横截面积显著优于普通NGC组，超微结构分析也证实该组肌丝排列更为整齐，有效缓解了失神经支配引起的肌肉萎缩。
成纤维细胞-EVs中富集miR-143-3p及其促再生功能
研究人员通过miRNA测序分析了成纤维细胞-EVs中的miRNA表达谱，鉴定出丰度最高的miR-143-3p。KEGG通路富集分析显示这些miRNAs参与了轴突导向等通路。在体外实验中，转染miR-143-3p模拟物后能显著增加运动和感觉神经元的突起生长，并促进轴突横切后的再生。在体内利用5毫米坐骨神经缺损模型证实，局部注射miR-143-3p agomir能显著促进轴突再生，而联合使用miR-143-3p antagomir则能部分抵消纤维母细胞-EVs的促再生作用，这表明纤维母细胞-EVs主要通过递送miR-143-3p发挥促再生效应。
miR-143-3p通过靶向下调Limk1促进轴突再生
机制探讨部分，研究人员利用生物信息学预测并经双荧光素酶报告基因实验证实了miR-143-3p与Limk1基因3′UTR的直接结合关系。实验证实，miR-143-3p能在转录后水平下调运动神经元中Limk1的mRNA和蛋白表达。通过siRNA敲低Limk1能够显著促进运动神经元的突起生长和轴突横切后的再生。回补实验进一步表明，同时过表达Limk1能够部分抵消miR-143-3p过表达带来的促神经元生长效应，证实miR-143-3p主要通过抑制Limk1这一轴突生长负调节因子来促进周围神经再生。
在讨论部分，研究人员指出，本研究构建的壳聚糖基NGC结合了天然多糖和EVs生物线索的双重优势。利用Matrigel作为EVs的缓释载体，能够维持其在体内的有效浓度并促进神经组织的有序再生。功能恢复、电生理和形态学结果充分证实了该设计的优越性。机制研究揭示了成纤维细胞-EVs递送的miR-143-3p能够通过靶向Limk1、解除其对轴突生长的抑制来促进周围神经再生。
研究结论部分总结道，研究人员构建了一种负载成纤维细胞-EVs的新型壳聚糖基神经导向导管。该新型NGC显著促进了感觉、运动和电生理功能的恢复，加速了轴突生长与髓鞘再生，并缓解了失神经肌肉萎缩。在机制上，成纤维细胞-EVs中富集的miR-143-3p通过靶向轴突生长负调节因子Limk1，在促进周围神经再生中发挥了关键作用。
